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本文由阿童木根据实践经验而整理，希望对大家有帮助。 原创微文，欢迎转发转载。 宏基因组分箱（Binning）是将宏基因组测序得到的混合了不同生物的序列或序列组装得到的contigs按物种分开归类的过程，类似下图（图0）。传统的单物种全基因组序列都是经纯培养之后，再进行全基因组de novo测序才获得的，但是环境中存在着大量的不可培养微生物，宏基因组分箱技术有助于获得不可培养微生物的全基因组序列，获得新物种的基因组序列和功能，预测未知物种的培养方法等等。 【图0】 一、分箱工具盘点 早在2011年，science上的一篇文章就用了宏基因组Binning技术对来自牛瘤胃的样本进行了宏基因组测序研究。该研究从268 Gbp的宏基因数据中成功Binning出了15个不能培养的微生物的全基因组序列（可见分箱对数据量要求很大）。从那以后，宏基因组Binning技术开始被更多的人关注和重视，也逐渐出现了很多宏基因组Binning工具。查了一些文献和资料，我罗列了一下近几年的分箱工具，引用量仅供参考（google学术，2019.8.29）。 【表1】 二、分箱工具比较 2017年Nature Methods上一篇文章对宏基因组数据处理各个过程中的软件进行了评估[ Critical Assessment of Metagenome Interpretation-a benchmark of metagenomics software ]。从文章的分析结果来看，不同的方法各有优缺（下图），MaxBin2可能是相对较好的一个分箱软件。 比较结果： 【图1】 加利福利亚大学在通过整合多个算法设计出了新的Binning软件DAS tool并在2018年发表在Nature Microbiology上 [ Recovery of genomes from metagenomes via a dereplication, aggregation and scoring strategy ]。集合了多个算法的DAS tool各项Binning指数要明显优于CONCOCT，MaxBin 2，MetaBAT等方法，比较分析结果如下： 比较结果： 对模拟微生物群落进行基因组重建分析 【图2】 对不同样本来源的宏基因组数据进行分箱完成度分析 【图3】 同年，Microbiome上发表了另一个整合了多个工具的分箱分析流程MetaWRAP [MetaWRAP—a flexible pipeline for genome-resolved metagenomic data analysis. Microbiome]。 MetaWRAP流程不仅纳入了最流行的MetaBAT、CONCOCT和MaxBin2分箱方法，还整合了质控、拼接、分箱、提炼、评估、注释等多种功能。MetaWRAP可以解决分箱分析中可能遇到的绝大多数问题，而且比较分析发现综合多个工具的MetaWRAP分箱法不仅比单个工具分箱效果好，也比同样是综合多个算法的DAS tool分箱法效果好，比较分析结果如下： 比较结果： 完成度和污染度的比较（CAMI数据集） 【图4】 完成度和污染度的比较（水、肠道、土壤数据） 【图5】 metaWRAP重组装分箱效果更佳 【图6】 三、分箱实战 MetaWRAP集合的算法和工具很全很多，但是也很慢，有条件的话可以自己尝试使用MetaWRAP。考虑到时间，下面只以MetaBAT2为例简介分箱工作流程。 1. 准备 下面是需要的软件和数据： 1) MetaBAT2地址： https:///berkeleylab/metabat/src/master/ ## 分箱工具 2) CheckM地址： https://github.com/Ecogenomics/CheckM/wiki ## 分箱质检 3) 数据地址： https://portal./dna/RD/Metagenome_RD/MetaBAT/Software/Mockup/ ## MetaBAT2测试数据 【图7】 ## 下载得到已经组装好的contigs文件assembly.fa和两个样本的bam文件。 2. 统计contig深度 jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth depth_var.txt *.bam
【图8】 第一列：contigName 第二列：contigLen 第三列：totalAvgDepth 第四列：library1.sorted.bam 第五列：library1.sorted.bam-var 第六列：library2.sorted.bam 第七列：library2.sorted.bam-var 3. 分箱 (4线程，21秒) time metabat2 -t 4 -i assembly.fa -a depth_var.txt -o metabat2/bin –v
【图9】 4. 分箱评估 (4线程，32分钟) time checkm lineage_wf -f metabat2/checkm.txt -t 4 -x fa metabat2/ metabat2/checkm/ ## 评估结果保存在checkm.txt文件中。 grep 'bin' checkm.txt | sed 's/^ //' | awk '{print $1,$2,$13,$14}' | sed 's/\ /\t/g'| sed 's/\./\t/' | sort -n -k 2 | sed 's/\t/./' > test.txt ## 从checkm.txt提取ID，Taxonomy，Completeness，Contamination信息。
【图10】 第一列：Bin Id 第二列：Marker lineage 第三列：Completeness 第四列：Contamination 到此就完成了两个样本的宏基因组分箱和分箱评估工作。这只是宏基因组分箱的简介，更全更详细的分箱分析可以参考MetaWRAP分析流程。 地址：https://github.com/bxlab/metaWRAP/blob/master/Usage_tutorial.md 参考： 1） https://mp.weixin.qq.com/s/BHCs2Y97jXL-2kInlu49UA 2） https://blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/83040987 3） http://blog.sina.com.cn/s/blog_9f23b9710102wu5t.html 感谢阅读~ |
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