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编译：萍水相逢，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读在废水处理中形成悬浮絮凝物和固定生物膜是异养反硝化的两种常用策略。这两种策略使用不同的碳源进行微生物聚集，其具有不同的生态位。作者假设这两种具有不同生态位的微生物聚集具有不同的微生物结构和代谢适应性。通过研究3个絮凝反硝化反应器和3个生物膜反硝化反应器，确定是否存在明显的微生物聚集。利用多组学方法来确定微生物群落组成，共现网络和代谢途径。研究结果表明：Proteobacteria是所有样本中最主要且最活跃的门；碳源在塑造微生物群落组成中起重要作用；而功能蛋白的分布在很大程度上受盐度的影响。我们发现拓扑网络特征具有不同的生态模式，生物膜反应器中的微生物比絮凝反应堆中的网络节点更多，但相互作用更少。生物膜反应器中生态位的巨大差异性可以很好地解释高微生物多样性，功能冗余和由此导致的系统高稳定性。此外与絮凝反应器相比，生物膜反应器中反硝化菌比例较低，对氧气和盐度扰动的抵抗力较高。研究结果支持作者的假设，即生态位差异导致不同的微生物结构，增加的微生物生态分布，这有助于提高系统效率和稳定性。 原名：Multi-omics analysis reveals niche and fitness differences in typical denitrification microbial aggregations 译名：多组学分析揭示了典型的反硝化微生物聚集中的生态位和适合度差异 期刊：Environmental International IF：7.943
发表时间：2019年8月 通信作者：阮贇杰 通信作者单位：浙江大学生物系统工程与食品科学学院 反应器配置和运行条件如表1所示。三个固相生物膜反应器使用聚丁二酸丁二醇酯(PBS)作为碳源：SA0和SA25是缺氧固定床反应器; SS25是需氧/缺氧序列分批反应器(Ruan等，2016)。LA0和LA25是两个缺氧液相絮凝反应器，它使用乙酸钠 (NaAc)作为碳源将水中C/N比调节到10。SA0、SA25、SS25、LA0和LA25均在实验开始前用从当地污水处理厂收集的活性污泥接种，并用与流入物相同的再循环水产养殖废水进料。从当地的全规模猪场废水处理厂(WWTP)取样LS0 (盐度，0‰)，该处理装置在序批处理条件下操作。根据标准方法 (SEPA，2002)测量进水和出水中的硝酸盐浓度，并根据先前的研究计算硝酸盐去除百分比和反硝化速率。
2 样品准备 从三个生物膜反应器中分别取50g PBS颗粒，加入50mL高压灭菌的软化水稀释，通过超声处理收集附着的生物膜材料，具体方法详见之前的研究。而三个絮凝反应器中的样品则在充分混合后各收集50 mL。RNA-固定剂 (RP1301, BioTeke Corporation, China)用于所有样品以抑制RNA的降解。将所有细菌样品通过0.22 μm无菌膜 (GTTP, Millipore-Isopore)过滤，将收集的滤膜置于液氮中保存以用于后续的基因组DNA，RNA和蛋白质提取。3 核酸提取与测序 基因组DNA和RNA利用Omega的E.Z.N.A.™ DNA/RNA/Protein Isolation Kit提取试剂盒提取。提取后RNA首先转逆转录为cDNA并定量。而16S-rRNA or 16S-rDNA genes (V3-V4区)则用引物341F (50-CCTACGGGNGGCWGCAG-30) 和805R (50-GACTACHVGGGTATCTAATCC-30) 进行扩增扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，利用纯化Agencourt AMPure XP Beads (A63881, Beckman, USA)进行纯化。纯化后的PCR产物通过Illumina MiSeq测序平台进行测序分析。4 nosZ、16S rRNA 和rDNA基因丰度测定 使用SYBR Green Real Time PCR Kit (Novland, Shanghai, China)对nosZ、16S rRNA或逆转录产物cDNA样品进行定量扩增。将基因拷贝数均一化为每纳克DNA或RNA中的基因拷贝数，并表示为细菌细胞数，因为每个细菌细胞的16S rDNA拷贝数平均为4.2，而nosZ基因通常携带一个拷贝。nosZ和16S rRNA基因的标准曲线的扩增效率分别为100％ (R2=0.999)和97％ (R2=0.999)。5 蛋白提取及蛋白质组学分析 使用SDS裂解法提取蛋白质，详尽步骤间文献Wang et al. (2012)。使用Bradford蛋白质测定试剂 (B6916, Sigma, USA)作为标准品测定蛋白质浓度。根据我们之前的研究进行蛋白质组学分析。简言之，通过胰蛋白酶消化100 μg蛋白质，并使用来自iTRAQ试剂盒 (Applied Biosystems, California, USA)的化学品标记所得肽混合物。使用强阳离子交换色谱 (SCX)柱纯化标记的样品，然后使用LC-20AB HPLC系统 (Shimadzu，Japan)通过液相色谱 (LC)分离。使用与TripleTOF 5600质谱仪 (AB Sciex，Concord，ON)接口的反相液相色谱系统(Eksigent)，通过MS / MS分析iTRAQ标记的样品。通过AB ProteinPilot v4.5软件(Applied Biosystem，USA)分析来自三个生物重复的iTRAQ数据，并通过Uniprot数据库 (www.uniprot.org)进行蛋白质/多肽注释。检测的蛋白质代谢路径通过KEGG数据库进行比对。6 数据分析 首先使用质量控制程序检测高通量测序的原始数据，并使用PRINSEQ软件(PRINSEQ-lite 0.19.5，日本)除去低质量序列。然后使用FLASH v.1.2.7软件(https:///projects/flashpage)合并clean数据以形成长度> 400 bp的序列。使用具有SILVA 16S数据库的Uchime软件除去嵌合体，并使用Mothur软件 (https://www./)中的pre.clust校正测序错误。最后得到的高质量序列根据相似性>97％的聚为一个操作分类单位 (OTU)。选择一个OTU中最丰富的序列作为该OTU代表序列进行生物学分类。利用Mothur软件确定OTU丰富度和α多样性指数 (即Shannon多样性指数，Chao1丰富度估计量和基于丰度的覆盖度估计量 (ACE)。分别在门水平和属水平上进行热图和PCoA分析，以比较所有反应器中细菌群落的组成和分布。该研究中六个反应器的硝酸盐去除百分比和反硝化速率详见表1。在生物膜反应器中，PBS同时用作生物膜载体和碳源，不添加任何液体碳源，生物膜附着在惰性介质可获得更长的污泥滞留时间 (SRT)。在较高的盐浓度和相同的进水硝酸盐负荷下，SA25的硝酸盐去除率和反硝化率均高于SA0。虽然SA25和SS25在相同的盐度条件下具有相似的硝酸盐去除率和反硝化率，但使用了不同的HRT和通气策略。在反应器运行60天后，LA0和LA25之间没有发现显著的反硝化速率差异性。研究结果表明，反硝化速率不受生物膜反硝化反应器中盐度(25‰)或间歇曝气的影响。这与先前的研究相反，之前报道盐度增加或间歇供氧总是通过抑制酶或与反硝化菌的电子竞争降低絮凝体系中的硝酸盐去除性能。在生物膜反应器中，在介质表面聚集的细菌可在生物膜内层产生缺氧环境，因为外层细菌在深入生物膜层之前消耗氧气。这种生态位使得兼性需氧细菌能够利用硝酸盐进行反硝化，使细菌能够承受轻微的氧气冲击。在LA0和LA25中，由于几乎完全去除了硝酸盐，人们可以认为没有达到最大的反硝化速率。LS0的高反硝化速率可以通过较高的进水硝酸盐负荷和较高的污泥浓度来解释，而LA0和LA25不行。2. 微生物群落组成分析 除了反应器SS25和LA25之外，通过TS序列计算得到的丰富度和生物多样性比通过GS计算得到的更低。与絮凝反应器 (即LA0、LA25和LS0)相比，生物膜反应器 (即SA0、SA25和SS25)显示出更高的细菌多样性。施加淀粉/聚乳酸混合物的生物膜脱氮系统比添加乙醇的系统具有更高的生物多样性。在生物膜系统中观察到的高多样性可能是生物膜系统的异质性和降解后碳源复杂性的结果，因为生态位可能能增加微生物多样性。相反，絮凝体系中养分的均匀分布往往会产生优势物种，从而降低了微生物的多样性。在生物膜反应器中，GS和TS序列数据计算均发现SA0具有最高的细菌丰富度和多样性，而在絮凝反应器中，LA0的多样性最低 (表S2)。营养不足的培养基可以产生更高的生物多样性，而当营养资源充足时，多样性反而会损失。SA0中较低的硝酸盐去除效率和由此产生的碳限制环境可以解释SA0的高度多样性。同样，LA0中高硝酸盐去除效率和由此产生的高碳环境也可以解释LA0中出现的最低多样性。此外，样品通过GS (生物膜反应器，4.9％;絮凝反应器，0.2％)数据分析得到的结果的共享OTU数高于通过TS (生物膜反应器，2.1％;絮凝反应器，0.0％)数据分析得到的结果 (图S1)。这表明，虽然通过DNA测序得到的结果显示样品间存在大量的共享OTU，但通过RNA测序的结果显示样品之间的OTU重叠度仍相对较低。
图1：6个反硝化反应器中微生物系统发育组成分析。(a) 基于基因组和转录组测序的微生物在门分类水平上的相对丰度；(b) 在门分类水平上相对丰度前10的转录组与基因组的比值。
图1显示了每个反应器中由基因组测序(GS)和转录组测序(TS)测序确定的在门分类水平下的相对丰度热图。通过GS和TS得到的在门分类水平上的相对丰度之间没有显著差异(p <0.05)。在所有样品中，Proteobacteria的丰富度最高 (82.21±15.82％)，其次是Bacteroidetes (9.79±9.29％)。为了预测样品收集时细菌的相对活性，平均相对丰度TS / GS的比例如图1b所示。在所有反应器中，Proteobacteria的TS / GS比率最高 (平均TS / GS = 1.28)，表明其在所有样品中具有高活性。得出该结果的依据是：γ-变形菌中鉴定出了最多的反硝化基因。在高盐反应器中，Proteobacteria的活性不太明显，而Actinobacteria和Verrucomicrobia在SA25高盐反应器中显示出高活性。生物膜和絮凝反应器均显示出不同的微生物群落组成，如基于OTU水平上的主坐标分析 (PCoA)显示 (图2)。碳源差异主要由PCoA1引起的，可解释总变异的21.2％。对于给定的系统，碳源对反硝化群落的潜在影响可能比其他因素更强，因为有机碳和能量代谢途径一般能决定异养细菌群落的生长。PCoA2占总变异的18.1％，与进水中盐度的变化有关。据报道，盐度在生物膜反应器中塑造微生物群落分布方面一直比氧气发挥更重要的作用。有趣的是，LA0和LA25簇以及SA25和SS25簇表明盐度浓度对絮凝反应器中的微生物群落组成影响不大，同样氧气浓度对生物膜反应器中的微生物群落组成影响不大。通过成对UniFrac距离计算的差异性表明，碳源和盐度对微生物组成的变化并没有明显的差别，测序 (GS或TS)对微生物群落预测的影响不大(P <0.05)(图2b)。在本研究中，GS和TS方法的结果之间的大量重叠表明，与转录组测序的结果相比，基因组测序是对细菌多样性和活性的预测的有前景的方法，而转录测序只能提供采样时刻的活性细菌。
图2：(a) 基于基因组和转录组的非加权UniFrac距离的PCoA分析；(b) 按碳源(生物膜和絮凝物之间)、盐度 (0‰和25‰之间)和测序 (基因组和转录组之间)分组的成对UniFrac距离分析。
3. 生态位与适应度的差异显示出明显的网络相关性 共现网络分析检测生物膜和絮凝体系，相对丰度> 0.1％的属水平上是否表现出独特的拓扑特征 (图3)。该网络在生物膜反应器中的59个属中产生了666个关联，在絮凝反应器中的57个属中产生了589个关联。六个反应器按其碳源 (即生物膜或絮凝物)或盐度 (即0‰或25‰)的状态分组，每组3个样品，以分析碳源和盐度如何影响节点数 (即属)和度 (即关联)。在所有类别中，通过基因组测序(标记为DNA)鉴定的节点数明显比通过转录组测序(标记为RNA)的节点数要多(p < 0.05) (图3c)。然而，通过基因组测序和转录组测序检测到度 (即关联)的数量相似 (图3d)。这表明DNA样本显示出与RNA样本相关的相似关联数，这意味着即使使用DNA样本，也可以预测活性物种的网络关联。目前的研究结果也与作者以前的研究结果一致，该研究发现网络相关分析是预测细菌功能组织的有效方法。图3显示，与絮凝反应器相比，生物膜反应器具有更多的网络节点，但度(相邻边缘的数量)更少。微生物群落的拓扑差异可能是由于运行条件变化导致反应器的生态位差异所致。随着生物膜的增长和由此导致的载体降解和营养物渗透，生物膜反应器显示出明显的生态位差异。生物膜中的生态位差异允许更多具有生态偏性的细菌群落共存，最终导致了我们观察到的节点数量增加的结果。然而，空间结构可能抑制细菌物种之间的相互作用 (即度)。在旋转生物膜反应器中，生物膜中氮和有机碳浓度随深度的变化而变化，微生物的组成和细菌的相互作用也随之变化，这意味着通过相关网络分析鉴定的功能性细菌具有生态位优先权。然而，在絮凝反应器中，营养物浓度更均匀，这使得微生物能够在具有更高相互作用的群落中共存。先前报道的弱生态分化可能导致微生物之间更强的相互作用。在土壤微生物群中观察到类似的结果，其中在降雨量大的地区发生了较强烈的相互作用，这可能是因为降雨使土壤栖息地更加均匀。
图3：细菌在属水平上的共现网络和拓扑特征。(a) 生物膜反应器上的网络相互作用，如SA0、SA25和SS25；(b) 絮凝反应器上的网络相互作用，如LA0、LA25和LS0。节点代表在属分类水平上的细菌，每个节点的颜色代表相对丰度的百分比，红线代表正相关，绿线代表负相关。拓扑特征包括节点数及与不同属相连的边数。
据报道生物膜系统在运行上比絮凝系统更稳定，因为生物膜固定的生理特性使其能够抵抗环境冲击，包括水力剪切力，溶解氧浓度和进水硝酸盐负荷的变化。生物膜系统稳定性的提高可以通过生物膜系统中较高的微生物生物多样性来解释，正如其他人在实证研究中所看到的那样。然而，作者的结果不支持这一理论，因为在当前研究或之前的研究中高稳定性的SA25系统的生物多样性并不比稳定性较低的SA0 (表S2)的生物多样性高。最近也有研究表明微生物多样性与系统稳定性之间的关系尚未确定，功能多样性或功能冗余可能是一种预测微生物群在扰动后的稳定性有前进的方法。具有多功能性、高度多样性微生物群的生态系统更能适应环境压力。采样反应器的稳定性可能与共现网络特征相关。与不稳定的絮凝反应器相比，更稳定的生物膜反应器具有更多度较小的节点 (图3)。同样，相比不稳定的淡水反应器，稳定的咸水反应器具有更多度较低的节点 (图3)。基于这些结果，作者得出结论，具有更高功能多样性 (节点)和更少相互作用 (度)的系统具有更高的稳定性，其中一种物种的变化不会影响其他物种的变化。该结论与前人研究的结果类似，即工程系统的稳定性与功能多样性而非种群多样性呈正相关。然而，想要更好地理解系统稳定性及其与生态和功能冗余的相关性，还需要进一步研究，以改进工程反硝化生物反应器的设计和管理，从而提高工艺稳定性。
图4：基于DNA和RNA样品的细菌总细胞数和反硝化细菌数。图中的数值表示反硝化细菌占总细菌的比值。
4. 功能基因定量 通过对DNA和RNA样品的qPCR定量，发现絮凝反应器中16S 基因的拷贝数 (DNA)和转录水平 (RNA)均高于生物膜反应器。在絮凝反应器中，碳源作为电子供体可以直接被细菌利用，而固体聚合物只能先通过其他细菌降解成单体后才能使用。在这种条件下，絮凝反硝化反应器具有较高的细菌生物量和反硝化菌 (图4)。尽管絮凝反应器的微生物多样性具有较低，但均匀的生态位对于反硝化菌显然更有利，正如前人所述，这可提供更有效的硝酸盐还原环境。在DNA样品中，平均有23.33％的细菌被鉴定为含有nosZ基因的反硝化菌，而在RNA样品中检测到的反硝化菌 (6.33％)较低。该结果表明并非所有的反硝化基因都会被转录，这可以通过作者实验中使用的适度进水硝酸盐负荷来解释。作者只定量了进行反硝化最后步骤的基因，即将一氧化二氮转化为氮气。更多的反硝化基因，包括硝酸还原酶 (Nar)，亚硝酸还原酶 (Nir)和一氧化氮还原酶 (Nor)，可用作生物标记，以量化反应器运行条件是如何影响反硝化基因的表达和反应器性能。
图5：蛋白数据的三元图。(a) 生物膜反应器；(b) 絮凝反应器。分布在中间的蛋白表示三个样品共有；分布在边上的蛋白表示两个样品共有；而分布在节点附件的则表示只在该样品中检测到。
5.絮凝反应器和生物膜反应器中的代谢适应 在6个反应器中共检测到2425个蛋白。图5显示在中间的蛋白表示该蛋白在三个样品中均检测到；在边上的表示只在两个样品中检测到；而在节点附件则表示只在该样品中检测到。图5表明，大部分蛋白在生物膜和絮凝反应器中均有检测到，表明该两个反应器具有相似的碳氮代谢功能。SA25和SS25之间存在很大的蛋白质重叠，这意味着蛋白质表达不受生物膜反应器间歇通气的强烈影响。然而，絮凝反应器显示出不同的适应性模式，因为它表现出一种更集中的蛋白质分布。在絮凝反应器中，絮凝物中的共聚集，细菌的共定殖或生态位重叠可能导致正相互作用。这些正相互作用包括不同的细菌簇，它们更相似的功能。这些功能性细菌可以解释所有絮凝反应器共有的集中功能蛋白质。这一观察结果与其他人提出的生态学理论一致，即生态位差异较小导致生物多样性低，功能冗余度低。
图6：与氮代谢、硫代谢、碳固定、TCA循环、氧气和盐度相关的蛋白质的两两比较。(a)生物膜与絮凝物，(b) 有氧/缺氧与缺氧，(c) 盐度25‰对比0‰。(d) 被上调和下调的蛋白质百分比。
通过热图 (图S2)和主成分分析 (图S3)进一步分析蛋白质的丰度和分布。结果表明，LS0和SA0聚集在一起，而SA25和SS25聚集在一起，说明盐度浓度对蛋白质分布的影响大于碳源。为了更好地理解每种细菌聚集的代谢适应性，作者比较了处理之间催化氮代谢，硫代谢，碳固定，TCA循环，氧和盐浓度的蛋白的表达量(图6，表S3)。与絮凝反应器相比，生物膜反应器中与碳固定，TCA循环，氧气和盐度相关的被下调的基因百分比更高 (图6a和d)。这意味着聚合物载体的缓慢降解所需要的与碳固定和TCA循环的蛋白质数量比絮凝体系中单体的降解需要更少。此外，与氧和盐浓度相关的蛋白表达被下调表明，生物膜反应器中形成的异质结构不易受到诸如氧和盐的扰动的影响。与氧气相比，硝酸盐和硫酸盐作为电子受体，其竞争性较低，这可解释为何间歇通气(即有氧/缺氧)能够下调与硝酸盐还原和硫酸盐还原有关的蛋白质表达 (图6b和d)。在相对高盐度条件下，含铜亚硝酸还原酶nirK和氧化亚氮还原酶nosZ的丰度降低，这与其他对脱氮系统的报道一致。生物营养废水处理的目的是满足相应功能性微生物组的生态位需求。实际操作过程总是导致资源的时间和空间划分。例如，在序批式反应器 (SBR)中总是观察到时间划分，在该反应器中，厌氧/好氧/缺氧 (AOA)过程在同一个系统中运行，该系统用于反硝化除磷以减轻微生物之间碳的竞争矛盾。在硝化和反硝化系统中总是观察到空间划分，其中好氧、缺氧过程在两个单独的系统运行以去除氨，以减轻硝化细菌和反硝化细菌之间氧竞争的矛盾。通过在废水处理过程中弥合时间和空间划分，可以实现成本效益。通过气升式悬浮反应器实现硝化和反硝化的同时进行，其中硝化作用位于悬浮的絮凝物中，反硝化则在附着了降解的生物化合物的生物膜中进行。此外，使用可生物降解的聚合物作为生物絮凝培养的碳源以进行氨同化。鉴于絮状物和生物膜反应器之间的生态位，拓扑特征 (图3)和代谢适应性 (图6)不同，因此呼吁从微生物生态学的角度研究创新的氮去除策略，其中包含可生物降解的聚合物和絮凝物。在一个反应器中，充分利用生态位，提高硝酸盐去除系统的效率和稳定性。
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