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编译：小太阳，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读环境刺激引发的气孔运动是调节植物吸收二氧化碳和水分流失的关键生理过程。气孔由感知和传递外部信号的保卫细胞组成，保卫细胞的变化会引起细胞体积和气孔孔径发生变化。在可见光谱中，红光会诱导完整叶片的气孔开放过程。然而，对于红光诱导的气孔开放是由保卫细胞直接感知红光引起的还是通过光合作用的间接影响引起的，这仍存在争议。本研究中，我们确证了导致离体表皮条红光诱导气孔开放和原生质体增大的条件，牢固建立了保卫细胞对红光的直接响应。借助于气相色谱串联质谱和液相色谱串联质谱技术开展了代谢分析，并探明了拟南芥保卫细胞在无叶肉细胞情况下对红光响应的代谢信号。对拟南芥保卫细胞中的223种代谢物进行了定量分析，发现有104种代谢物与红光响应有关。这些受红光调节的代谢物主要参与三羧酸循环、碳平衡、植物激素生物合成和氧化还原稳态等过程。我们进一步对选定的拟南芥突变体进行分析，发现对红光的气孔开放响应与保卫细胞中脱落酸含量降低和茉莉酸含量升高有关。本研究中针对红光处理的保卫细胞代谢轮廓分析结果为后续自主性红光信号传导通路的研究提供了基础。 原名：Metabolomics of Red Light-Induced Stomatal Opening in Arabidopsis thaliana: Coupling with Abscisic Acid and Jasmonic Acid Metabolism 译名：红光诱导拟南芥气孔开放的代谢组学分析：耦合脱落酸和茉莉酸的代谢 期刊：The Plant Journal IF：5.726 发表时间：2019.11 通讯作者：Sarah M. Assmann 将蚕豆种子播种于土壤中，置于光照周期为8 h/16 h，白光强度为125 μmol m-2s-1，昼夜温度为22℃/20℃的短日照生长室中培养3周，用于气孔孔径测定。将用于气孔孔径测定的拟南芥种子接种于1/2 Murashige &Skoog培养板上培养使其发芽，在培养板上培养10天后，将其转移至5种不同生长条件的土壤中育秧。其中4种生长条件设置在Conviron生长室中。这4种生长条件均控制昼夜温度22℃/20℃和光照周期8 h/16 h。但白光强度和湿度存在四种不同的组合：条件1:125 μmol m-2s-1，在托盘顶部覆盖圆顶以保持湿度；条件2: 125 μmol m-2s-1，无圆顶覆盖；条件3: 300 μmol m-2 s-1，在托盘顶部覆盖圆顶以保持湿度；条件4: 300 μmol m-2s-1，无圆顶覆盖。“低湿度”，即托盘无圆顶覆盖，湿度为50%-55%，“高湿度”，即托盘顶部有圆顶覆盖，湿度为85%-90%。条件5:温室环境，平均光照时间为16 h，平均光照强度为300 μmol m-2s-1，全天温度均不低于25℃。生长室中开启光照前，立即将3周龄蚕豆、4-5周龄或5-6周龄的拟南芥植株上完全伸展的叶片摘除。温室中培育的植株须在上午9点之前将叶片摘除。摘除的叶片用于气孔孔径生物测定。在已有报道方法的基础上制备表皮条和叶片（大约5 mm*5 mm）。将表皮条或叶片置于MES/KCl缓冲液（5 mM KCl、1 mM CaCl2和10 mM MES-KOH, pH6.15）中，在黑暗条件下孵育1.5-2 h以确保气孔闭合。然后将表皮条或叶片转移至含有5 mM KCl, 0.1 mM CaCl2的培养液中并置于红光下照射。红光照射 3 h后，将处理好的表皮条或叶片置于Nikon DIPHOT 300光学显微镜下观察气孔变化，将Nikon E990数码相机安装在显微镜上拍照。利用 Image J 软件对气孔孔径进行测量。每个实验重复 3-5 次，每个样品测定105±5 个气孔。将用于原生质体分离的拟南芥在短日程生长室中进行培育，控制光照周期为 8 h/16 h ，白光强度为300 μmol m-2 s-1，且昼夜温度为22℃/20℃。从 4-5 周龄的拟南芥植株上采集完全伸展的叶片用于分离保卫细胞。首先，采集约 300 片完全伸展的叶片，放于盛有冷水的搅拌器中混合 4-5 次，每次约 30 s。混合结束后，用自来水彻底冲洗表皮并将其转移至 200 mL 第一酶解液中：0.1% (w/v) 吡咯烷酮-40, 0.25%(w/v)牛血清蛋白第五组份, 0.3% 纤维素酶 R-10, 0.3% 纤维素酶绿色木霉和0.02 % 离析酶 R-10, 溶于 55% (v/v) 的基本介质中。本研究中准备了含有K+和不含K+的基本介质，以测试K+在保卫细胞红光响应过程中的影响。不含K+的基本介质含有0.55 M山梨醇、0.5 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2、0.5 mM 抗环血酸和10 mM MES-Tris,pH 值为5.5;含K+的基本介质含有约0.51 M 山梨醇、0.5 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2、20 mM KCl、0.5 mM 抗坏血酸和10 mM MES-Tris, pH值为5.5。将表皮置于28-29℃，转速为140 rpm条件下振荡消化约 50 min。将消化后的果皮通过100 μm滤网进行过滤，以保留果皮，然后将果皮转移至第二酶解液中： 0.25% (w/v) 牛血清蛋白第五组份, 0.8% (w/v) 纤维素酶和0.02% (w/v) 果胶酶Y-23，溶于 100%的基本介质中。在 20℃，50 rpm条件下消化约 1 h。然后将其通过20 μm尼龙滤网，并且用600-800 mL基本介质进行冲洗，从而得到含有原生质体的滤液。将滤液在转速为150 g 条件下进行离心 15 min，然后加入等体积的Histopaque，再离心5 min以获得原生质体。使用移液管收集两相之间的原生质体，并用基本介质对其进行彻底清洗。最后将原生质体置于 1mL 悬浮溶液中悬浮。采用细胞计数器对原生质体进行计数。获得的原生质体可以置于冰上避光放置1 h，然后恢复至室温放置 15 min。取 0.2 mL 原生质体悬浮液置于红光下照射，或在黑暗环境下分别放置 0、30 和 60 min。照射结束后，在 150 g条件下离心 5 min以收集原生质体。将获得的原生质用液氮冷冻，并置于-80℃冻存用于后续分析。3 保卫细胞原生质体中代谢物的提取和基于多反应监测模式的LC-MS/MS分析本研究中采集 16000 片叶片，共分离出 2亿个拟南芥保卫细胞原生质体用于代谢组学研究。提取代谢物之前，将 4-6 个保卫细胞原生质体悬浮小球汇成一个生物学重复，每个生物学重复中大约含有 4,000,000 个保卫细胞原生质体，每组设置 5 个生物学重复。加入100 μL预冷的提取液（甲醇：氯仿：水（v/v/v）3：1：1），4 °C避光涡旋4 min。提取过程重复 3 次，并将3 次提取液合并后冻干。用45 μL50%的甲醇将冻干产物复溶，室温下涡旋 15 min，然后在4°C, 13,000 g条件下离心 15 min，取上清液上机分析。在多反应监测模式进行数据采集。色谱条件：色谱柱型号为 XDB-C18，流动相为 0.1%的甲酸水溶液（A）和 0.1%的甲酸乙腈（B）。流动相梯度：1% B，0~5 min；1%~99.5% B，5~41.5 min；99.5% B，保持 41.5 min ~46 min；99.5%~1% B，46 min ~46.3; 1% B,46.3~55min。流速为0.5 mL/min。质谱条件：气帘气 30 psi，GS1和 GS2 分别为 50 psi 和 55 psi，离子源电压为 4500 V，离子源为 ESI 源。离子源温度为 350℃。在正负离子模式下对 340 种植物初级和次级代谢物离子碎片进行采集。4 表皮条的制备、代谢物提取和气相色谱串联质谱分析采集在短日照生长室中（光照周期 8 h/16 h，光照强度300 μmol m-2s-1，昼夜温度22°C/20°C）培养的拟南芥叶片，用于制备富含保卫细胞的表皮条。在植物生长过程中，在托盘上覆盖圆顶以保持较高的湿度。采集的4周龄的拟南芥叶片，置于盛有冷水的混匀器中搅拌混匀3~4 次，每次持续 30 s。混匀后，将表皮置于100 μm滤网上，用自来水彻底冲洗干净，然后用含有5 mM KCl 和0.1 mM CaCl2的缓冲溶液进行冲洗。取适量表皮置于含有5 mM KCl和0.1 mM CaCl2的小孔中，置于红光或避光条件下 0 min、30 min、1h 和 3 h。照射结束后，立即将表皮放入液氮中冷冻，用于后续代谢物提取。将表皮条放入预冷的研钵中，加入液氮，研磨成粉。加入200 μL预冷的提取液（甲醇：氯仿：水 (v/v/v)3：1：1），4 °C避光提取20 min，提取过程重复 3 次，将提取液合并后冻干。在每个生物学重复中，加入10 μL MOX 试剂，28°C孵育90 min，加入90 μL衍生化试剂（BSTFA＋1% TMCS），在60°C，400 rpm条件下振荡孵育 1 h，随后12000 rpm离心15 min，取上清液用于质谱分析。每针进样量为0.5 μL，升温程序：初始温度为50 °C，保持1 min；以10 °C/min速度升温至315 °C；315 °C，保持10 min。借助于QTRAP 4000靶向代谢组学分析平台采集的代谢物离子碎片信息，用MultiQuantTM软件确定每个代谢物的峰面积并用内标进行校正。依据标准品的离子对信息、保留时间等信息，将从样品中得到的色谱峰与之进行匹配，并进行相对定量分析。首先采用 KNN 法插补缺失值并使用Combat处理批次效应；对每一个时间点的峰面积进行对数转化，然后进行t检验以找到对红光处理做出响应的代谢物；借助于EDGE揭示了每个时间点和整个时间段中对红光处理做出响应的代谢物；借助于MetaboAnalyst 3.0软件进行代谢通路分析；借助于Cytoscape软件进行代谢物的互作网络分析；使用聚类分析对鉴定出的代谢物进行分组。我们首先构建了蚕豆和拟南芥的不同生长环境，以观察红光照射下的离体表皮条的气孔开放。几十年来，蚕豆一直是研究保卫细胞生理机制的常用模式材料。我们发现，在光照周期为8 h/16 h，光照强度为125 μmol·m-2·s–1的生长室环境中，红光能够诱导蚕豆表皮条上的气孔开放（图 1A）。我们也很好奇拟南芥离体表皮条会对红光的响应特征，尤其是考虑到拟南芥具有可利用的优良遗传资源。将拟南芥置于生长室中培养，控制光照周期为8 h/16 h，光照强度为125 μmol·m-2·s–1，然而在拟南芥离体表皮条中并未观察到红光诱导的气孔开放（图 1B）。而在光照时间更长，光照强度更高，高温高湿的温室环境中培养的拟南芥植株上发现了红光诱导的气孔开放（图 1C）。为了在可控条件下大规模种植拟南芥以用于保卫细胞的原生质体分离，我们模仿温室环境建立了生长室，以增强拟南芥保卫细胞对红光的自主响应。设置两个光照强度（低：125 μmol·m-2·s–1；高：300 μmol·m-2·s–1），通过有无圆顶覆盖控制湿度（高湿度：有圆顶覆盖；低湿度：无圆顶覆盖）。高光照强度促进植物生长：高光照强度下培育的4-5 周龄拟南芥与在低光照强度下培育的 5-6 周龄的植株长势相似，并因此用于气孔生物测定。只有在高光照强度和高湿度环境下培育的拟南芥表皮条对红光表现出明显的响应（图 1D）。本研究证实了DCMU可抑制表皮条对红光的响应，且具有明显的剂量依赖效应，这一研究结果也与先前在蚕豆中报道的结果一致。生长室环境的构建增加了原生质体的年累积量，由于受其他类型细胞的污染较小，所以成为了组学研究的优质实验材料。
图 1 不同生长条件下的蚕豆和拟南芥离体表皮条上的气孔对红光的响应（A）生长室环境下（光照周期8 h/16 h，光照强度125 μmol·m-2·s–1）培育的蚕豆。不同环境条件下培育的拟南芥：（B）生长室环境（光照周期8 h/16 h，光照强度125 μmol·m-2·s–1），（C）温室环境，（D）生长室环境（光照周期8 h/16 h，光照强度不同：低光照强度：125 μmol·m-2·s–1和高光照强度300 μmol·m-2·s–1，湿度（高湿度：有圆顶覆盖，低湿度：无圆顶覆盖）。暗处理或红光处理 3 h 后对气孔进行观察和拍照。
在红光(125 μmol·m-2·s–1)照射下，在高强度光照(300 μmol·m-2·s–1)和高湿度条件下培育的拟南芥表皮条气孔开度与K+无关。因此，我们分别制备了含有K+和不含有K+的溶液来处理保卫细胞原生质体，进一步探究K+在红光响应中的作用。红光照射一段时间后，通过测定保卫细胞原生质体直径以评估保其对红光的响应特征。与暗处理的对照组相比，在不含K+的溶液中发现，红光照射 1 h 后，保卫细胞原生质体膨大。相反，在K+浓度为20 mM的溶液中，保卫细胞原生质体初始直径较大，但红光照射 1 h 后并未发现原生质体膨大。但是在整个照射过程中，与暗处理的保卫细胞原生质体相比，红光处理的原生质体直径和体积更大。总之，这些结果可以证实，用含K+和不含K+的两种溶液进行处理，拟南芥的保卫细胞原生质体均表现出对红光的响应。有一项重要研究显示，运用代谢组技术研究拟南芥保卫细胞中脱落酸的代谢变化时，鉴定出 85 种代谢物并对其进行了定量。在该研究基础上，我们对监测离子列表进行了扩充。本研究的一个主要目标是扩大拟南芥保卫细胞的代谢物的检测范围。本研究制备了约2亿个拟南芥保卫细胞原生质体，用于代谢组学分析。我们在拟南芥保卫细胞中总共鉴定出 205 种代谢物（图 2）。
图 2 基于互补的代谢组学分析平台获得的拟南芥中 223 种代谢物代谢轮廓。（A）基于化学结构特征对代谢物进行分类。（B）不同代谢组学分析平台鉴定出的代谢物数量的韦恩图。
t 检验结果显示，在红光照射过程中，不含K+溶液处理的保卫细胞原生质体中，在30 min时有 14 种代谢物，在 60 min 有 38 种代谢物在表现出红光响应。EDGE 分析结果显示，在 30 min和 60 min 时分别有 5 种和 59 种表现出红光响应，而且在不含K+溶液处理的保卫细胞原生质体中发现有 51 种代谢物具有红光响应（图 3）。同样的，在含20 mM K+溶液处理的保卫细胞原生质体中，在 30 min 和 60 min 时分别发现 35 和 20 种代谢物表现出红光响应。在整个红光处理过程中，发现 27 种代谢物表现出红光响应。在不含K+和含K+溶液处理的保卫细胞原生质体中发现，总共分别有 71 种和 50 种代谢物表现出红光响应。在含K+和不含K+溶液处理的保卫细胞原生质体中，有10 种具有红光响应的代谢物在特定的时间点表现出相同的变化趋势：脱落酸、脱落酸葡萄糖酯、丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、蛋氨酸、肌氨酸、氧化型谷胱甘肽和甘草素。
图 3 代谢组学数据汇总。（A）通过不同分析方法揭示不同分析平台（LC-MS/MS和 GC-MS/MS）和不同实验材料（保卫细胞原生质体和表皮条）鉴定出的红光响应代谢物。（B）每个时间点对红光产生响应的代谢物增加和减少的数量。
我们还对红光处理 3 h的拟南芥表皮条进行了GC-MS/MS 分析，以鉴定参与红光诱导气孔响应的潜在渗透剂。排除蜡质成分后，共鉴定出31 种潜在的保卫细胞代谢物。通过 t检验和EDGE分析显示，在红光处理期间，只有 3 种，α-甘油磷酸、3-脱氧叶酸和创伤霉素表现出红光响应。这些数据与液相色谱质谱分析的数据具有重叠，这也说明气相色谱质谱分析与液相色谱质谱分析在代谢组学分析中具有互补性。将在保卫细胞中鉴定出的具有红光响应的 104 种代谢物进行通路富集分析（图 4）。匹配到的代谢通路主要涉及氨基酸代谢，尤其是精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸。并且发现了参与三羧酸循环和糖酵解代谢的几种代谢物受到红光调节（图 5），包括琥珀酸、丙酮酸、乌头酸、草酰乙酸、ATP、GDP、6-磷酸葡萄糖和 6-磷酸果糖。在这些受红光调节的代谢物中，如3-磷酸甘油醛、6-磷酸果糖和 6-磷酸葡萄糖与碳平衡相关。由于鉴定出还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、抗坏血酸和脱氢抗坏血酸等物质，所以可以说明氧化还原稳态与拟南芥气孔的红光响应有关。例如，在经红光照射的保卫细胞原生质体中，氧化型谷胱甘肽水平升高。此外还发现，红光处理可增加与抗氧化相关的代谢物（如抗坏血酸、类黄酮和甘草素）的水平（图 6）。
图 4拟南芥保卫细胞中具有红光响应的代谢物的通路富集分析结果。
图 5在红光处理过程中，拟南芥保卫细胞中涉及三羧酸循环和碳平衡的代谢物的倍数变化情况。
图 6在红光处理过程中，拟南芥保卫细胞中涉及氧化还原稳态的代谢物的倍数变化情况。
对不含K+（71 种代谢物）和含K+（50 种代谢物）溶液的保卫细胞原生质体中的鉴定出对红光具有响应的代谢物进行相关性分析，分别鉴定出 5 种主要的时间分布类型。在不含K+的情况下，大多数的代谢物相互联系形成一个密集的代谢网络（图 7A）。仔细观察可以发现，这个密集的代谢网中涵盖了 30 种代谢物，这些代谢物经红光照射而呈现下降趋势。这些代谢物主要包括脱落酸和脱落酸葡萄糖酯、茉莉酸合成的前体物质和氨基酸（图 7A）。相反，K+存在时，仅鉴定出一个含较少代谢物的松散代谢网（图 7B）。目前，对于K+如何调控保卫细胞代谢组变化还尚未明确。但可以明确的是，K+不会对代谢物起到渗透调节作用。通过比较在K+存在与否的情况下获得的相关性代谢网络可以发现，红光处理均导致脱落酸水平下降而茉莉酸水平上升（图 7 和图 8）。在通路富集分析结果中并未发现红光会诱导保卫细胞中的重要激素发生变化，而相关性分析结果则相反，这也突出了相关性分析的重要性。
图 7 含K+和不含K+的保卫细胞原生质体中受红光调节的代谢物的相关性分析结果（A）不含K+溶液中的拟南芥保卫细胞原生质体中的红光响应代谢物组成的密集代谢网络。（B）含20 mMK+的溶液中拟南芥保卫细胞原生质体中的红光响应代谢组成的松散代谢网络。
图 8 红光处理过程中，拟南芥保卫细胞内脱落酸和茉莉酸代谢通路中相关代谢物的倍数变化情况。
5 植物激素生物合成缺失突变体对红光的气孔响应发生改变无论K+存在与否，与脱落酸和茉莉酸合成相关的代谢物及其衍生物均表现出红光响应（图 7 和图 8）。具体来说，红光照射后，脱落酸在60 min时降低。相反，脱落酸葡萄糖酯在 30 min 的出现显著上升。红光照射 60 min 时，保卫细胞中原生质体中的12-O-植物二烯酸和二氢茉莉酸水平均降低。与暗处理对照组相比，仅在含 20 mM且红光处理60 min时的保卫细胞原生质体中发现茉莉酸水平升高。基于以上结果，我们在相关拟南芥突变体中对红光诱导的气孔响应进行了表型分析（图 9）。几种脱落酸合成缺失突变体的表皮条和叶片的气孔对红光响应均增强。但这种增强的响应并未在脱落酸受体RCAR四倍突变体中发现。以上结果，结合红光处理后的保卫细胞中脱落酸水平发生下降（图6A）以及外源脱落酸(50 μM)抑制红光诱导的气孔开放，这均说明红光响应过程中保卫细胞内出现了脱落酸合成和转换的调控。脱落酸水平降低可促进红光诱导的气孔开放。此外，我们还发现两种茉莉酸生物合成缺失突变体（CS6149 (aos)和jar1)的气孔对红光的响应发生了变化。这两种突变体的表皮条和叶片的气孔对红光的响应均降低（图 9B）。在另一个茉莉酸缺失突变体CS3748中也发现，气孔开放对红光的响应下降，且与伤后茉莉酸积累减少有关的脂氧合酶 2 的活性降低。这些结果也进一步证实了我们在代谢组学分析中的发现。
图9 125 μmol m-2 s-1红光处理下，拟南芥植物激素生物合成缺失突变体（A-B）和钾转运缺失突变体（C）中气孔开度变化情况
有趣的是，在含K+和不含K+的保卫细胞原生质体中，红光处理引发的代谢变化是不同的（图 3 和图 7）。会发现在20 mM K+溶液中的保卫细胞原生质体的初始直径更大。这些结果表明，K+可能参与拟南芥保卫细胞的红光响应过程。在红光处理之前，通过比较含K+和不含K+的保卫细胞原生质体中初始代谢物组成，发现保卫细胞中的K+可以调控细胞的代谢变化。结果显示，共有 64 种代谢物受外源添加K+的调节，并且通路富集分析结果揭示了这些受K+调节的代谢物主要参与三羧酸循环和乙醛酸及二羧酸代谢（包括琥珀酸、异柠檬酸、草酰乙酸、顺乌头酸、柠檬酸和磷酸烯醇式丙酮酸）以及氨基酸代谢（尤其是丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和脯氨酸）。K+诱导的拟南芥保卫细胞的初级代谢变化表明，K+在自主保卫细胞响应中不仅仅是起到渗透剂的作用。本研究中的代谢组学分析结果还揭示了在K+存在与否的情况下，保卫细胞原生质体中受红光调节的代谢物之间存在不同。选择K+通道缺失突变体观察气孔对红光的响应（图 9C）。在两种KAB1突变系中均发现，表皮条上的气孔对红光响应幅度下降。在一种KAT1突变系中也发现了类似的变化，但在另外一种突变系SALK_127506C上未发现显著变化。在其他K+通道突变系中，气孔对红光的响应并不显著（图 9C）。这些差异可能是由于拟南芥中存在多种不同的K+通道家族导致的。K+参与保卫细胞中红光响应的生理机制目前尚未明确。在多种植物的完整叶片中均发现气孔对红光产生响应。然而，红光诱导的气孔开放是一种自主的保卫细胞应答反应，还是由叶肉光合作用以及由此引起的Ci 或其他代谢物的减少导致的间接应答反应，仍存在争议。本研究中，我们对拟南芥的生长环境进行了优化，并发现在高光照强度和高湿度环境下，离体表皮条的气孔对红光的响应会增强（图 1）。在本研究中设置的光照强度300 μmol m-2s-1，要比生长室中培育拟南芥通常用的光照强度更强。然而，根据我们参考的关于日照的NASA卫星成像数据来看，该光强度在拟南芥野外生存环境的自然光照强度范围内。大多数拟南芥品种均来自于夏季日平均太阳辐射为90-160W m-2的地区，并且白天的最高峰值可达到1000 W m-2。根据光合有效光子通量和太阳总辐射的比值报告，对于峰值大约2000μmol m-2s-1平均日光强度，这些值可近似转换为180-320μmol m-2s-1。因此，300 μmol m-2s-1为环境相关光照强度，通常用此光照强度来培育拟南芥。高强度光照增强离体表皮条上气孔对红光的响应可能与保卫细胞叶绿体中的光合作用有关。光合电子传递产生 ATP 和还原剂（如 NADPH）供于保卫细胞的渗透调节过程。保卫细胞内的光合碳同化作用产生具有渗透性的糖和淀粉，它们可以转换成苹果酸和糖，这均有助于气孔开放。我们发现，DCMU 可抑制拟南芥表皮条对红光的响应，且存在有剂量依赖效应。这一结果也与之前在蚕豆表皮和拟南芥完整叶片中的研究结果一致，表明了光合磷酸化作用在保卫细胞对红光直接响应过程中的作用。此外，我们还发现，对生长室中培育的拟南芥表皮条而言，高湿度是促进气孔开放另一个关键因素（图 1）。已有研究报道，其他刺激的生长条件依赖性响应也会调节保卫细胞的气孔开度，尤其是二氧化碳和蓝光。当相对湿度提高时，温室培养的蚕豆叶片中二氧化碳响应会增强，这可以说明空气相对湿度是介导气孔对二氧化碳敏感性的关键环境因素。由此，我们可以得出结论，保卫细胞对红光的自主响应程度受物种和生长条件的影响，至少在拟南芥中是这样的。此外，在拟南芥保卫细胞原生质体中发现红光会诱导代谢物水平发生变化，这可以说明保卫细胞具有直接感应红光的能力。因此，完整叶片中保卫细胞的红光响应可能是由于保卫细胞自主感应红光，但这也并不能排除叶肉细胞光合作用参与的可能性。由于代谢组学的发展以及高纯度、高产量保卫细胞实验材料的成功分离，使得保卫细胞代谢组学在过去的几年中得到长足的发展。例如，在油菜的保卫细胞中已经发现有几百种小分子代谢物。目前，只有一项代谢组学研究是针对拟南芥保卫细胞开展的，在拟南芥保卫细胞中共鉴定和定量了 85 种小分子代谢物。我们目前的研究将拟南芥的代谢物种类扩展到200多种化合物，进一步提高了我们对保卫细胞代谢的了解。与叶肉细胞相比，保卫细胞几乎不含叶绿体且光合活性低。保卫细胞光合作用在多大程度上对气孔响应发挥作用仍存在争议。30年前，采用放射性同位素标记实验证明了蚕豆保卫细胞原生质体中光合碳固定的过程，随后也得到了其他研究者的证实。红光处理可以增强保卫细胞光合碳固定：在光照过程中发现，中间代谢产物 3-磷酸甘油酸水平降低，而磷酸糖水平升高。这与我们的研究结果一致，我们发现红光照射使得拟南芥保卫细胞中6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖水平升高。尽管 6-磷酸葡萄糖和 6-磷酸果糖可由淀粉分解而来，但并未有研究发现保卫细胞对红光响应过程中会出现淀粉分解过程。经红光处理后，拟南芥保卫细胞原生质体中葡萄糖含量下降，但降幅并不显著。葡萄糖的来源还不清楚。我们也鉴定出几种参与糖酵解和三羧酸循环的代谢物，这也与保卫细胞比叶肉细胞含有更多的线粒体这一事实相符，这也可能会促进能量产生以供给气孔运动。经红光处理后，琥珀酸、丙酮酸、草酰乙酸、6-磷酸葡萄糖和 6-磷酸果糖的含量升高，这说明红光处理加快了产能过程，而ATP 和 GDP 含量下降说明，红光诱导的气孔开放增加了能量消耗。我们的代谢组学数据表明，氧化还原稳态与保卫细胞的红光响应有关。氧化还原调节在保卫细胞对脱落酸和病原体响应中早有记载。红光诱导的光合作用中氧气的产生，也会提高活性氧水平，而活性氧在促进气孔闭合过程中起重要作用。本研究中，我们发现抗氧化物（例如抗坏血酸和甘草素）升高有助于抵消 ROS 的产生，从而促进红光诱导的气孔开放。最近研究发现，黄酮类物质的增加会抑制脱落酸诱导的活性氧爆发，从而促进气孔开放。在光诱导的气孔开放过程中已鉴定出多条由K+、Cl-、苹果酸和或可溶性糖组成的渗透调节代谢通路。已经发现蔗糖的积累与蚕豆中保卫细胞的红光响应有关。前人借助于液相色谱技术对蔗糖、果糖和其他可溶性糖进行了定量分析，发现在K+存在的情况下，这些代谢物对累积渗透起重要作用。在20 mM K+存在的情况下，红光处理会诱导纤维二糖和核糖的产生。这些糖是否作为渗透剂起作用尚不明确。游离氨基酸及其衍生物是细胞内主要的有机渗透物。在应激情况下植物体内氨基酸会发生累积，如脯氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。红光诱导拟南芥保卫细胞原生质体中（含K＋和不含K＋）产生丝氨酸。但是，保卫细胞原生质体中丝氨酸的积累量低于2 mM，所以起到的渗透作用很小。在不含K+的保卫细胞原生质体中发现苹果酸对红光有响应，但其丰度却随照射时间的延长而出现下降。这可能表明，与蓝光诱导的气孔开放不同，苹果酸在红光诱导的气孔开放过程中不作为渗透剂起作用。有报道称，K+吸收和苹果酸合成与清晨气孔的快速开放有关。尽管在下午时发现蚕豆表皮条内蔗糖含量增加，但并不能肯定蔗糖是调节气孔孔径的主要渗透剂。此外，蔗糖的主要作用还是供能。这些不同通路的参与可能取决于一天内不同的时间点、品种、生长条件和实验条件等。K+存在不会影响拟南芥表皮条上气孔对红光的响应。这一结论与之前的研究结果一致。在K+存在情况下对蚕豆进行红光照射(100 μmol m-2 s-1)，发现保卫细胞原生质体中K+吸收受限。在低含量二氧化碳存在情况下，研究人员发现红光处理使得蚕豆保卫细胞在低浓度二氧化碳刺激下发生K+内流，这表明K +作为渗透剂性的作用可能会因CO2浓度不同而存在差异。为了研究K+对拟南芥保卫细胞红光响应的影响，我们对保卫细胞原生质体进行了两种处理：使用K +（溶液含20 mMKCl）或不使用K +（溶液中无K+）。不含K+暗处理和红光处理样本的保卫细胞直径在 30 min 时的差异比外源添加K+的差异小。30 min时，在含K+的保卫细胞原生质体中鉴定出较多对红光产生响应的代谢物（图 3）。此外，在含和不含K+的情况下，保卫细胞原生质体中识鉴定出的红光响应代谢物总数不同，这表明K+会调节保卫细胞的代谢。通过对比含K+和不含K+保卫细胞原生质体中初始代谢物的组成发现，外源添加K+会改变能量代谢。特别是，与不含K+的保卫细胞原生质体相比，含有K+的保卫细胞原生质体中三羧酸循环和乙醛酸代谢中的几种代谢产物水平更低，表明保卫细胞中能量代谢状态发生变化，可能反映出K+存在时对无机渗透物的依赖性更大。有趣的是，外源提供葡萄糖或蔗糖会诱导拟南芥气孔关闭，但在葡萄糖不敏感突变体gin1-1和gin2-1中不存在这种情况。与不存在K+的保卫细胞原生质体相比，含20 mMK+的原生质体中葡萄糖水平约下降30%。前人发现在K+存在时，（白色）光诱导的气孔开放期间，蔗糖水平显著降低。蔗糖的主要功能并非是作为渗透剂起作用，而是作为糖酵解和TCA循环的底物，为谷氨酰胺的生物合成提供碳骨架。本研究发现K+在红光响应过程并非作为渗透剂起作用，而是作为信号分子来影响参与红光响应的碳和氮代谢途径。加之在一些拟南芥K+通道突变体kat1和 kab1，尤其是在离体表皮条中发现红光诱导使得气孔响应降低。这些结果表明K+在拟南芥保卫细胞红光响应中具有重要作用，但目前还未彻底探明其具体作用机制。植物激素不仅仅直接参与调节气孔运动，而且还参与调节气孔对外部信号的响应。近期研究发现，对拟南芥进行局部光胁迫后（如用最适合强度的光照2000 μmol m-2s-1，仅照射一片叶子），需要脱落酸来触发系统性气孔关闭。本研究中发现，红光会诱导拟南芥保卫细胞原生质体中植物激素出现波动，尤其是脱落酸和茉莉酸。红光照射 1 h 后，在含K+和不含K+的保卫细胞原生质体中，脱落酸均出现下降（图 8）。此外，在脱落酸缺失突变体中，红光诱导的气孔开放响应增强（图 9A）。这些数据表明，内源性脱落酸对拟南芥中红光诱导的气孔开放具有抑制作用，并且红光在一定程度上通过信号机联反应导致保卫细胞中脱落酸含量降低，从而促进气孔开放。前人使用免疫组化技术研究发现，红光会诱导拟南芥完整叶片中出现质膜H+-ATP酶磷酸化，且这种磷酸化作用与红光诱导的气孔开放有关。此外，外源施用脱落酸会抑制红光诱导产生的 ATP 酶磷酸化作用。因此，本研究发现，红光诱导拟南芥保卫细胞原生质体中脱落酸含量下降可能减轻了内源脱落酸对H+-ATP酶的钝化。H+-ATP酶活性增强可能与通过H+/蔗糖协同转运子转运的蔗糖积累有关，这也进一步增强了红光诱导的气孔开放响应。在另一项保卫细胞代谢组学研究中，提高橄榄型油菜和野生型拟南芥保卫细胞中的二氧化碳含量会导致茉莉酸代谢通路中的几种代谢物丰度发生变化。高二氧化碳胁迫会导致茉莉酸植物活性形式茉莉酸、茉莉酸甲酯和茉莉酸异亮氨酸含量增加，而在茉莉酸合成分支点上的一些茉莉酸前体物质和代谢物（如 9-氧代壬酸）含量出现降低。相反，这些变化并未在对高含量二氧化碳不敏感的拟南芥二氧化碳信号突变体ca1ca4中发现。此外，在茉莉酸生物合成突变体jar1和茉莉酸信号转导突变体coi1和jin1中发现，二氧化碳浓度升高诱导气孔关闭的敏感性降低。这些结果表明，对二氧化碳浓度升高诱导的气孔关闭至少在一定程度上依赖于茉莉酸来激活。也有人提出，脱落酸和茉莉酸协同作用于气孔关闭响应。有研究发现，脱落酸处理会导致拟南芥保卫细胞原生质体中植物激素水平发生变化，包括茉莉酸水平上升和生长素水平下降。前人还发现，茉莉酸甲酯能够刺激AtNCED3基因的表达，这种基因能够编码一种关键的脱落酸合成酶，这表明内源性脱落酸参与茉莉酸甲酯诱导的气孔关闭。然而，在本研究中，我们观察到在不含K+的保卫细胞原生质体中，红光处理导致茉莉酸水平升高而脱落酸水平下降（图8）。因此，脱落酸和茉莉酸可能在红光诱导的气孔开放中起拮抗作用。与此假说一致，茉莉酸缺失突变体对红光的气孔响应受损（图 9B），表明茉莉酸水平增加对红光诱导的气孔开放非常重要。我们的发现为经红光处理的保卫细胞中脱落酸和茉莉酸之间不同的相互作用模式研究提供了依据。有一种可能是，茉莉酸对气孔生理特性的影响具有剂量依赖效应。综合起来，我们数据表明精密的植物激素网络在保卫细胞应对外界刺激的响应中具有十分重要的作用。本研究中，通过构建植物不同生长条件，发现参考物种拟南芥表皮条中红光诱导的气孔开放响应增强，并且我们应用代谢组学技术探究了拟南芥细胞中受红光调节的代谢物的种类。借助于靶向代谢组学LC-MS/MS平台和GC-MS/MS平台，在拟南芥气孔保卫细胞中共鉴定出 223 种代谢物，并发现有104 种代谢物对红光存在响应。我们的结果表明，保卫细胞可以直接感应红光。并且还发现红光处理改变了保卫细胞中的三羧酸循环、碳平衡过程、植物激素生物合成和氧化还原稳态等过程。综合采用拟南芥突变体进行的气孔生物学测定结果，发现气孔对红光的响应涉及脱落酸和茉莉酸植物激素代谢，并且K+可能在保卫细胞对红光的响应中起信号分子的作用。本研究对保卫细胞的代谢物特征谱图进行了扩充，并为增进我们对保卫细胞中自主红光信号通路的理解提供了基础。
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