【原】科研 | Gut：肠易激综合征和胆汁酸吸收障碍患者与非肠易激综合征患者粪便微生物组和代谢组的差异

微生态 2021-04-13

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编译：莫沉，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

肠易激综合征(Irritablebowel syndrome, IBS) 作为一种异质性疾病，其诊断和亚型的确定通常要基于症状。在本实验中，研究者分析了IBS患者和非IBS患者的粪便微生物群落，以确定这种疾病的生物标志物。本研究共收集了80名IBS患者(RomeIV criteria; 年龄16-70岁)和65名匹配的非IBS患者(对照组)的粪便和尿液样本，以及常规的医学和饮食信息。分别对上述粪便样本进行Shotgun和16S rRNA扩增子测序，并对尿液和粪便代谢物进行气相色谱和液相色谱-质谱联用分析。基于数据之间显著的Spearman相关性生成同现网络，同时通过对放射标记的硒-75牛磺胆酸，确定腹泻患者存在明显的胆汁酸吸收不良(Bile acidmalabsorption, BAM)。与对照组相比，IBS患者在饮食和粪便微生物之间的网络关联上有显着差异，同时都伴随着粪便代谢物的差异。此外，研究者并未发现不同IBS症状亚型患者的粪便微生物组成有显著的差异，而粪便样本的代谢谱则可以较好地区分IBS患者和对照组。尽管尿液代谢物在IBS患者和对照组之间也有显著差异，但大多数差别代谢物与饮食或药物有关。粪便代谢组，而不是微生物组，可以显著区分患者IBS有和没有BAM症状。尽管IBS具有较高的异质性，但患者的尿液和粪便代谢物及粪便菌群与对照组有着显著的差异，且与IBS的症状亚型无关，同时粪便代谢组分析可用于区分有无BAM的IBS患者。上述研究可用来开发基于肠道微生物的针对IBS的治疗策略。

论文ID

原名：Differences in Fecal Microbiomes and Metabolomes of People With vs Without Irritable Bowel Syndrome and Bile Acid Malabsorption

译名：肠易激综合征和胆汁酸吸收障碍患者与非肠易激综合征患者粪便微生物组和代谢组的差异

期刊：Gastroenterology

IF：19.233

发表时间：2019.04

通讯作者：Paul W. O’Toole

作者单位：爱尔兰科克大学微生物系

实验设计

1 IBS和对照组的微生物组不同，但在IBS临床亚型之间不存在差异。

表1中显示了研究对象的描述性统计数据。通过16S rRNA基因扩增片段测序和微生物组的PCoA分析表明，IBS患者的微生物组与对照组有显著差异(图1A)。将这些菌株水平的变量进行分析，可以将IBS与对照组进行显著的区分，如图1b所示。将机器学习应用于宏基因组物种(metagenomic species, CAGs)数据集，根据136个预测特征，生成IBS预测模型，AUC为0.814(灵敏度为0.875，特异度为0.497)。在物种水平上，Ruminococcus gnavus 和Lachnospiraceaespp在IBS中的数量明显较多，而Barnesiellaintestinihominis 和Coprococcus catus在IBS中的数量明显较少，这些变化与以前的研究类似。然而，IBS的临床亚型在来自16S rRNA基因图谱数据的微生物组 (个体间) β多样性的PCoA中没有分离(图1C)。此外，在属和种水平上的宏基因组衍生的组成(使用shotgun序列数据进行分配)表明了IBS患者和对照组之间的微生物组成差异。

表1 对照组和IBS受试者的描述性统计

图1 对照组和肠易激综合征组的微生物组成分析。(A)微生物区系β多样性的主坐标分析(PCoA)显示对照组和IBS组之间存在显著差异。在16s属水平采用Spearman距离进行PCoA(p值=0.001；对照：n=63，IBS =78)。(B)后基因组物种分析(CAGS)的PCoA显示对照组和IBS组之间存在显著差异。(对照组：n=59；IBS =80)。(C)不同IBS临床亚型间微生物区系组成的PCoA差异无统计学意义(P>0.05)。在16sOTU水平采用Spearman距离进行后交叉韧带置换术(p值=0.976；IBS-C=29，IBS-D=20，IBS-M =29)。(D)对照组和IBS组的猎枪属概况(对照组：58例，IBS组：78例)。(E)对照和IBS组微生物区系网络的关联性。

2 胆汁酸吸收不良的肠易激综合征患者粪便微生物群改变

由于一些IBS-D患者可能患有胆汁酸吸收不良(BAM)，这将影响转运时间和可能的微生物组成，研究者测试了19/21名IBS-D患者，26/29名IBS-M患者和9/65名对照组的SeHCAT滞留，这是量化BAM的金标准。根据目前的指南，未能保留>15%的标记胆汁酸类似物被归类为BAM，10-15%的保留被归类为轻度BAM，5-10%的保留被归类为中度BAM，<5%的保留被归类为重度BAM。在45名接受测试的IBS患者中(图2A)，18人被诊断为BAM，其中4人为重度BAM，7人为中度BAM，7人为轻度BAM。另有5例患者被分类为交界性BAM(保留16-20%)，在接受测试的IBS人群中，有40%的人报告BAM分类为阳性。正如预期的那样，BAM阳性诊断在IBS-D(74%)比在IBS-M(35%)更常见(p值=0.03)(图2A)。只有重度BAM类型的IBS患者的微生物组成与BAM诊断为正常、轻度、中度或临界值的患者的微生物区系有明显的分离(图2B)。为了进一步研究BAM的生物学影响，我们进行了GC-MS和LC-MS的非靶向性粪便代谢物分析。患有严重BAM的IBS患者的粪便代谢组与接受SeHCAT的IBS患者的其他BAM级别的粪便代谢组有显著不同(图2C)。研究者将机器学习应用于接受SeHCAT的IBS受试者的粪便代谢组数据集。预测模型成功地识别了所有四个BAM等级中AUC为0.83(敏感性为0.88，特异性为0.67)的BAM受试者。该模型对重度和中度BAM的准确率为100%，对轻度BAM的准确率为71.4%，对交界性BAM的准确率为80%。BAM的主要预测代谢物是甘油磷脂、寡肽。这些化合物水平的升高与脂肪酸新陈代谢改变和疾病有关。

图2 SeHCAT检测受试者胆汁酸吸收不良的分布、微生物组和代谢组谱。(A)对照组和IBS患者的SeHCAT保留率。(B)在16s OTU水平上，使用Spearman距离测试的肠易激综合征患者的微生物区系组成的PcoA显示不同的BAM类型之间没有显著差异(p值=0.289)。(C)粪便代谢组学的PcoA分析显示，肠易激综合征患者的BAM分级之间存在显著差异，采用Spearman距离(p值=0.001)。

3 肠易激综合征患者的尿液和粪便代谢物改变

由于代谢分析对区分患有BAM的受试者很有帮助，我们将其应用扩展到所有受试者，最初将重点放在尿液作为非侵入性测试样本。研究者比较了FAIMS分析挥发性有机物和GC/LC-MS联用分析挥发性有机物的两种方法。FAIMS技术不能直接识别鉴别代谢物，而是通过电离代谢物的特征流将样品/受试者分开。在非监督分析中，FAIMS很容易从对照组和IBS(图3A)中识别出尿液样本，但不能区分IBS临床亚型。对尿液代谢物的GC/LC-MS分析也将IBS患者与对照组区分开来(图3B)，并且比FAIMS具有更高的准确性。机器学习确定了可以预测肠易激综合征的尿液代谢组学特征(AuC1.000；敏感性：1.000，特异性：0.9)。在IBS受试者中，89种尿代谢物的含量明显减少，其中包括一些氨基酸，如L-精氨酸，它是一氧化氮生物合成的前体，与粘膜防御和IBS病理生理学都有关。另有38种代谢物在IBS中的水平明显升高，包括酰甘氨酸(N-十一酰甘氨酸)和酰肉碱(癸酰肉碱)，这些群体的代谢物水平升高与脂肪酸氧化/新陈代谢改变和疾病有关。用GC/LC-MS分析IBS患者和对照组的粪便代谢物(图3C)，临床IBS亚型之间也没有差异。

图3 对照组与肠易激综合征尿液和粪代谢产物的比较分析。(A)尿液挥发性有机化合物(FAIMS)代谢物的PCoA分析 (P值=0.001；对照组：n=65；IBS：n=80)。(B)使用Spearman距离对尿液MS代谢组学进行PCoA分析 (P值=0.001；对照组：n=63；IBS：n=80)。(C)利用Spearman距离进行粪便MS代谢组学的PCoA分析。(P值=0.001；对照组：n=63；IBS：n=80)。

4 饮食、微生物组和代谢组的综合分析揭示IBS的主要变化

研究者利用加权相关网络分析(Weighted Correlation Network Analysis, WGCNA)探讨IBS和对照组中饮食、微生物组和代谢组之间的相互作用(图4)。与两个IBS相关子网中的稀疏连接相比，控制主体子网具有连接密度高、特征类型多样的特点。IBS患者控制子网络中被耗竭的物种包括Paraprevotella and Bacteroides species (B4), Barnesiellaintestinihominis , Eubacteriumeligens , Ruminococcus lactaris , Eubacterium biforme , Desulfovibriodesulfuricans 以及Coprococcus和Eubacterium species (B1). 与IBS相关的物种包括IBS子网I中的Ruminococcaceae ,Lachnospiraceae, Alistipes 和 Bacteroides species (B3)以及IBS子网II中的Bifidobacteriumadolescentis 和Streptococcusspecies (B2)。总体而言，Bacteroidetes spp的降低与之前的研究结果类似。此外，与饮食的不同关联是对照组和IBS子网的一个主要区别特征。控制子网络的主体结构由嵌入在子网络中的5个膳食数据节点(节点D1、D3-6)和外围的一个节点(节点D7)支撑，代表了正常微生物组成与习性饮食的协变。膳食节点D6，代表高纤维饮食，明显减少了IBS受试者的频率，这与先前对IBS患者纤维摄入量的荟萃分析中的发现一致。这个D6节点与细菌分类以及控制子网络中的粪便和尿液代谢物都有很好的联系。唯一远离对照组(D2)的饮食节点与IBS人群相关，主要是加工过的和高血糖指数的食物，但其与细菌功能的相关性非常弱，也不是IBS相关亚网络的组成部分，这些观察结果反映在对IBS患者和对照组人群饮食成分的成对比较中。

图4 跨多个基因组数据集的结构和共丰度的可视化。节点表示来自基于加权相关网络分析(WGCNA)的聚类的数据集中的共同丰富变量。边缘(线条)表示IBS组和对照组中饮食、微生物组和代谢组之间的显著交互作用。总体结构显示了一个大型的单个控制关联子网络和两个IBS关联子网络

结论

本研究表明，IBS患者的肠道微生物组成与对照组不同，并反映在粪便代谢物中。然而，宏基因组和代谢组构型并不能有效区分IBS的临床亚型(IBS-C，-D，-M)。同时，研究者还发现，患有胆汁酸吸收不良的IBS-D和IBS-M患者的粪便代谢物发生了改变，可以在不需要SeHCAT(75 Selenium (Se) homocholic acid taurine)检测的情况下区分这些患者。对饮食-微生物-代谢轴的综合分析显示，与对照组相比，IBS患者的饮食成分与肠道微生物的相互作用，并揭示了一组不同的粪便代谢物，这些代谢物可能驱动或延续IBS综合征。

与大多数慢性非传染性疾病类似，肠易激综合征具有高度的异质性，其严重程度从妨害性肠障碍到社会功能障碍不等，并伴有明显的症状异质性。虽然通常被认为是由于脑肠轴的紊乱，但目前尚不清楚肠易激综合征是始于肠道还是始于大脑，还是两者兼而有之。感染后的IBS的症状表明，尽管有易感危险因素，但有一部分病例是从终末器官开始的，其中一些可能是心理因素。随着微生物组研究的进步，越来越多的证据表明，肠道微生物组对神经发育，甚至可能对行为产生了改变的影响，拓宽了头脑/身体联系的概念，使之涵盖了微生物组-肠道-大脑轴。然而，由于缺乏可靠的生物标志物，理解和治疗IBS一直受到限制，其分型和诊断仍然是由症状来定义的。此外，目前根据主要症状(腹泻为主(IBS-D)或便秘为主(IBS-C))将患者分层为临床亚型的方法也有很大的局限性。而设计用来治疗相反症状的药物，如果给错误分类的患者开处方，则可能会产生严重的不良反应。因此，为了对IBS患者进行循证分层，研究者对80名IBS患者(罗马IV标准)和65名对照进行了粪便样本的宏基因组研究以及尿液和粪便的代谢组学分析。结果发现，在IBS中有明显的微生物群和代谢特征，但这些特征独立于IBS的传统临床症状亚群(IBS-D与IBS-C，IBS交替或混合)，也不同于BAM的微生物群和代谢特征。

上述研究结果具有重要的临床指导意义。

① 肠道微生物组以及粪便、尿液代谢组入手研究，可以为IBS提供客观的生物标记物，很容易转化为临床实践。

② 粪便代谢谱与BAM相关联，这可以将其与非BAM相关的IBS区分开来。

③ IBS的传统Rome亚型不受微生物组和代谢组差异的支持，因此是时候寻找另一种疾病分类的依据。

④ 虽然这些结果并没有以任何方式影响IBS脑-肠轴改变的概念，但其指出了在IBS发病过程中饮食-微生物-代谢轴的紊乱，这与许多患者的表型相一致，可以为将来IBS治疗干预的设计提供参考依据。

此外，研究者认为，目前对IBS临床亚型的分层不应该成为治疗决定的基础，因为肠道微生物的改变 (与对照对象相比)在亚型上是相似的，与许多患者在便秘和腹泻形式之间的交替是一致的。通过粪便菌群和代谢组学分析(因此排除了BAM患者，他们将被规定使用胆汁酸螯合剂)，然后通过治疗纠正改变的微生物组、代谢组和饮食相互作用网络，可以实现更详细的分层。此外，将IBS患者与对照人群区分开来的宏基因组和代谢组学特征可能是这些微生物定向治疗的靶点。

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