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编译：艾奥里亚，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 土壤微生物作为众多生态过程的重要媒介，其在恢复干扰后的生态系统中起着至关重要的作用。下一代测序技术的发展使得我们对生态系统恢复过程中的微生物分类变化得到了广泛的研究，但仅描述微生物群落结构很难与微生物介导的生态系统过程相联系。基于鸟枪法宏基因组测序，我们分析了自植树造林以来6-31年间矿山土壤与未开采参考土壤的15个土壤基因组。分类学和功能的变化表明从富营养型群体向寡营养型群体转变，增加了稳定碳源的新陈代谢和对植被的影响。与转座因子、毒力、防御力和应激反应相关的基因增加表明，随着时间序列，微生物之间的合作和竞争性的相互作用有所增加。在N循环中，氨和亚硝酸盐氧化细菌在恢复过程中显着增加，但与N循环相关的功能基因却仅有很小的变化。在所有重新造林的土壤中，甲烷营养菌和甲烷单加氧酶基因的相对丰度较低，这解释了先前的观察结果：造林后31年，这些地点的甲烷消耗量尚未恢复。本研究有助于了解土壤微生物组与生态系统恢复之间联系的相关机制，特别关注氮循环和温室气体排放，以更好地了解土壤微生物在恢复生态系统功能中的作用。 论文ID 原名：Changes in microbial functional genes within the soil metagenome during forest ecosystem restoration 译名：森林生态系统恢复过程中土壤宏基因组内微生物功能基因的变化 期刊：Soil Biology and Biochemistry IF：5.3 发表时间：2019年5月 通讯作者：Shan Sun 作者单位：弗吉尼亚理工大学 实验设计 结果 1 鸟枪法宏基因组测序结果 鸟枪法宏基因组测序产生了约2.27亿个总序列，每个样品平均约1500万。其中，未通过质量控制的序列占比2.81%，未鉴定为rRNA和蛋白质的序列占比2.71%，鉴定为rRNA的序列占比6.61%，鉴定为已注释的蛋白质占比20.8%，未知蛋白质为67.1%。 2 分类学和功能基因丰度 采用NMDS可视化分析，分别基于物种和功能基因组成计算样品对之间的Bray-Curtis距离，以了解微生物在分类和功能方面的变化。如图1所示，基于物种组成的β多样性模式通常沿着6年至31年的时间序列过渡。Actinobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相对丰度与样品的排列显着相关（FDR= 0.004–0.016，R2= 0.52–0.81）（图1a和c），Actinobacteria以及Bacteroidetes在恢复早期时更丰富，而Acidobacteria在恢复后期更丰富。相比之下，基于功能基因组成的排序图显示了不同的模式（图1b）。未开采地点更类似于恢复了22年的样地，并偏离了恢复6至31年的总体轨迹。在level1水平上，一些功能类别相对丰度的变化与排序显著相关（FDR= 0.002-0.034，R2= 0.47-0.88），这其中包括氨基酸和衍生物（AAD）、细胞分裂和细胞周期（CDCC）、细胞壁和胶囊（CWC）、辅酶因子、维生素、脂肪酸、脂质、氮代谢（NM）、核苷和核苷酸（NN）、噬菌体、转座因子、质粒（PPTP）、蛋白质代谢（PM）、呼吸（Res）、应激反应（SR）以及毒力、疾病和防御（VDD）等（图1b和d）。PPTP、SR和VDD随着时间序列而增加，而CVPP、CWC和FLI则降低。未开采地点的RES资源丰富，而AAD、CDCC、NM、NN和PM相对丰度较低。在生态系统功能方面，TMB，SIR和CH4通量与功能基因谱的相关性略有显着性（FDR= 0.049–0.054，R2= 0.47–0.59），TMB，SIR和CH4的消耗量较高与未开采的地点表现出相关性关系。 3 高水平上分类学变化的模式 基于与MG-RAST数据库进行比对，其中细菌序列占比97.64%，古菌序列占比0.59%，真核生物占比1.61%，病毒占比0.02%。在门水平上的主要物种包括Alphaproteobacteria、Actinobacteria和Betaproteobacteria，分别占所有分类注释的34.1%、18.5%和12.5%（图2）。Acidobacteria在宏基因组数据库（6.77%）中比扩增的16SrRNA序列中的细菌（21.5%）少，而两种方法都鉴定时，Alphaproteobacteria较为丰富。 相对丰度>0.5%的门水平上和proteobacterial科水平上，随着年代顺序的不同而变化（图2）。Actinobacteria在恢复5年的样地更丰富，而Alphaproteobacteria在未开采的参考样点更为丰富。Bacteroidetes的相对丰度在恢复早期相对丰度较高，而Acidobacteria的相对丰度在恢复较长时间的样地中较高。为了进一步检验这些趋势，进行了线性回归以量化跨年龄段（恢复6-31年）的分类学变化的重要性（图2）。Actinobacteria的相对丰度随着年龄的增长而从恢复6年样地的27.1%下降到恢复31年样地的13.2%（FDR= 0.032，R2 = 0.59），而Acidobacteria的相对丰度从恢复6年样地的4.0%增加到恢复31年样地的11.2%（FDR= 0.047，R2 = 0.52）（图2）。在相对丰度较少的细菌门中，Euryarchaeota、Aquificae、Nitrospirae、Thermotogae、Deferribacteres和Zetaproteobacteria均随恢复时间的增加而增长（FDR= 0.015-0.047，R2= 0.52-0.72），其中Zetaproteobacteria和Nitrospirae的效果最强。在占主导地位的Alphaproteobacteria细菌中，还分析了此类细菌的有序水平变异。随恢复时间的增加变化，Caulobacterales和Sphingomonadales的相对丰度降低（FDR= 0.0027–0.047，R2= 0.43-0.72），而Rhodospirillales的相对丰度则显着增加（FDR= 0.0027，R2 = 0.69）。 4 功能变化模式 基于Subsystem数据库，将21个功能基因归属于level1水平上。其中Clusteringbasedsubsystems（CBS）、碳水化合物（CH）、蛋白质代谢（PM）、氨基酸和衍生物（AAD）分别占注释基因总数的14.2%、11.8%、10.4%和10.3%（图3）。在所有类别中，毒力、疾病与防御（VDD）、应激反应（SR）、噬菌体、转座因子和质粒（PPTP）、晚期代谢和次级代谢（SM）更为丰富（图3）。光合作用基因在恢复6年的样点具有较高的相对丰度，而在未开采位点，编码钾代谢和芳香族化合物代谢（MAC）的基因的相对丰度较高。在这些类别中，PPTP、SR、VDD、SM和膜转运（MT）的相对丰度随着恢复年龄的增长而增加（FDR= 0.035–0.077，R2= 0.44–0.62），而FLI和CVPP的相对丰度则降低（FDR= 0.012-0.040，R2= 0.53-0.73）（图3）。 5 与氮循环有关的变化 为了探究造林后微生物氮循环的潜在变化，我们进行了更有针对性的分析，重点是分类单元和已了解的影响氮转化的功能基因的相对丰度。对于硝化作用，在恢复6至31年的样点中，氨氧化细菌（AOB）从0.61%增加到0.97%，亚硝酸盐氧化细菌（NOB）从2.5%增加到3.3%（FDR= 0.050和0.047，R2= 0.41和0.47）。然而，未开采地的NOB相对丰度进一步提高到4.2%，而AOB在恢复31年的样地中最高，而在未开采地降低到0.63%（图4）。功能组内还表现出额外的复杂性，特定分类群随时序年龄而变化。例如，在氨氧化菌群中，Nitrosomonas、Nitrosospira和Nitrosococcus（AOB）从恢复6年到31年逐渐增加（FDR= 0.036-0.076，R2= 0.32-0.53），但它们在未开采的地点都较少（图4a）。相反，Nitrosopumilus（最丰富的氨氧化古菌（AOA））在6到31年内没有显着变化，但从先前开采的位置的0.0074%上升到未开采的位置的0.020%（图4a）。 在亚硝酸盐氧化菌群中，Nitrobacter的相对丰度在6-31年（FDR= 0.050，R2 = 0.43）从2.5%显着增加到3.2%，在未开采的地点进一步增加到4.1%。同时，Nitrococcus在6至31年的位点（FDR= 0.0097，R2 = 0.68）也从0.069%显着增加到0.11%，但在未开采位点的平均丰度仅为0.095%（图4a）。总体而言，Nitrobacter是占主导地位的NOB，通常比其他细菌更丰富一个数量级，因此其丰富程度主要驱动了总NOB模式。在功能基因中，硝酸还原酶（EC 1.7.99.4），也称为亚硝酸盐氧化还原酶，催化硝化和反硝化作用，在早期阶段更为丰富（图4b）。 反硝化菌的系统发育多样性很高，其多样性大于50个属同时亚硝酸盐还原酶基因的广泛分布使得很难提供一个完整的参与反硝化的生物列表。为了克服这一挑战，通常将反硝化而不是分类单元相关的基因作为靶标，以探究环境中反硝化细菌的潜在活性。在整个时间序列中，序列丰度的变化表明在恢复早期阶段反硝化作用更为活跃。例如，编码亚硝酸还原酶[NAD(P)H]大亚基（EC1.7.1.4）的基因和来自甲酸/亚硝酸盐家族的亚硝酸盐转运蛋白从6到31年样点显着下降（FDR= 0.028，R2 = 0.63和0.66）（图4b），转运蛋白基因显示出更强的效应。但是，就测得的生态系统过程而言，分类学变化与土壤NH4+或NO3-的浓度以及N2O的排放速率均不相关。关于N2O的产生，一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶在各个年龄段均未显示出明显的趋势（图5b）。一氧化氮还原酶激活蛋白norE和N2O释放是仅有的相关基因（FDR= 0.057，R2 = 0.46） 6 与甲烷循环有关的变化 可代谢甲烷产生碳和能量的Methanotrophs，在属水平上占所有分类序列的1.1%，而在厌氧呼吸过程中使用CO2作为电子受体并产生甲烷的产甲烷菌仅占序列的0.12%。随着恢复时间的增长，所有特征化的甲烷营养生物都显着增加了约2到3倍（FDR= 0.0013–0.016，R2= 0.49–0.78）（图5a）。在未开采的地点发现Methylocella，Methylocystis以及Methylosinus的最高相对丰度分别为0.71%、0.27%和0.28%。相反，在恢复31年的样点中，Methylobacter以及Methylococcus的丰度最高，分别为0.095%和0.20%（图5a）。然而，Methylocella，Methylocystis以及Methylosinus占所有甲烷营养生物的76.7%，因此它们主要带动了总体甲烷营养生物的趋势。对于产甲烷菌（methanogens）、Methanothermobacter，Methanoculieus，Methanospirillum，Methanoregula以及Methanosarcina属随着时序年龄的增加显着增加的相似效应（FDR= 0.0024–0.018，R2= 0.47–0.70），但它们的丰度远低于甲烷甲烷菌。Methylocella，Methylocystis以及Methylosinus的相对丰度变化均与CH4的排放速率显着负相关（FDR= 0.00002–0.0002，R2= 0.76-0.85） 在参与甲烷循环的功能基因中，未检测到甲基辅酶M还原酶基因（参与甲烷生成的主要基因），这表明甲烷的净通量主要取决于甲烷营养生物的变化。与甲烷单加氧酶有关的基因以及在甲烷氧化过程中代谢甲烷的功能性基因，在时间序列上没有显着变化。但是，这四个类别的总和从恢复31年样点的0.013%急剧增加到未开采站点的0.029%（图5b），进一步支持了甲烷消耗仅在未开采站点活跃。此外，甲烷单加氧酶基因相对丰度的变化与CH4排放速率显着相关（FDR = 0.0012–0.0036，R2 = 0.49–0.65）。 讨论 1 分类变化 根据样本之间的Bray-Curtis距离，微生物群落的相似性再次与时序年龄相关，随着年龄的增加，微生物群落的结构与未开采的参考土壤更加相似（图1a）。有研究发现，变化较为强烈的Acidobacteria以及Nitrospirae几乎增加了一倍，而Actinobacteria的丰度几乎减半。这些变化支持了先前描述的从富营养型到寡营养型的转变。在7个主要细菌中，α变形杆菌，Caulobacterales和Sphingomonadales减少，而Rhodospirillales增加。Sphingomonadales与植物相互作用并可以利用根系分泌物，因此树冠的发育和恢复后期草皮的降低可以用于解释Sphingomonadales的减少。在其他系统中，根系生物量表现出随草地优势的降低而减少。相比之下，森林土壤中的Rhodospirillales比草地土壤中的更为丰富，并且与不稳定的土壤养分（如溶解的氮和有机碳）呈负相关。由于根际通常营养丰富，因此在本研究中取样的土壤中，更深的根际植被的变化还可以减少表层10cm土壤中的不稳定矿物成分。这样的转变还可以进一步解释浅层土壤中的寡养菌随着恢复时间的延长而增加的原因。总体而言，我们的结果支持从草木为主的植被过渡和土壤养分的变化是驱动森林生态系统恢复过程中微生物群落变化的重要因素。 2 碳循环 功能基因相对丰度的变化也表明，森林演替过程中资源有效性和微生物相互作用是土壤微生物组响应的关键。在碳代谢方面，与光合作用相关的基因在恢复6年样点中最为丰富。功能基因的变化同样表明，在异养生物中，随着时间序列的增加，土壤群落正在适应从不稳定的C化合物向稳定的C化合物的转变。例如，与多糖代谢有关的基因相对增加，而与单糖代谢有关的基因则相对减少。考虑到寡养生物倾向于具有较低的周转率，随着时序年龄的增长，参与level2水平的细胞分裂的基因数量的减少也支持了从富养到寡养的转变。此外，添加氮后从贫营养型转变为营养型组会导致呼吸速率降低，这与我们的观察一致。作为土壤碳库的重要组成部分，呼吸作用的增加可能是由于寡养菌对顽固碳库的更多利用。 3 生物相互作用 土壤是噬菌体、原噬菌体和转座因子的储存库，这些可遗传因子可以塑造微生物群落。例如，由于对群落压力（如营养缺乏或温度变化）的响应，在这个时间序列中，转座因子的序列增加了20%以上。在整个时间序列中，涉及毒力、疾病和防御（VDD）的基因丰度增加了约25%，这表明种间微生物竞争也随着年龄的增长而增加。当检测营养竞争时，细菌可以增加抗生素和细菌素的产生。在VDD类别中，被分类为毒素和超抗原的基因的相对丰度虽然较低，但随着时序年龄的增长大约增加了三倍，而对抗生素和有毒化合物的抗性增加了20%左右，这与竞争的加剧相吻合。恢复时间的增加解释了相互作用相关功能类别变化中的47%以上，这说明微生物之间合作或竞争的相互作用的增加与生态系统的发展密切相关。 4 氮循环 N循环生物的丰度变化表明整个N循环的变化以及功能组内的变化。例如，随着时序年龄的增长，AOB和NOB都增加了30%以上，这表明向硝化菌增加的方向的转变。但是，AOB在恢复31年时达到峰值，而AOA在未开采的位置最高。随着年龄和土壤碳氮比的增加，AOB-AOA的变化与以前的报道一致，即AOB通常居住在富含铵的环境中，而AOA较少依赖于铵浓度。尽管未开采地的总氮最高，但随着时间的推移，土壤中的氮往往会嵌入复杂的有机化合物中，此后土壤氮的生物利用度高度依赖于土壤有机质中结合的氮的解聚（SOM）。NOB内部也发生了类似的分类变化。硝化细菌、硝化球菌和硝化螺旋菌均随年龄顺序的增加而增加。硝化细菌的亚硝酸盐亲和力低于硝化螺旋藻，这表明硝化细菌更适合于亚硝酸盐浓度较高的环境。 5 甲烷循环 除未开采的地点外，所有地点的甲烷营养菌和甲烷单加氧酶基因的相对丰度均降低，这与之前的研究相一致。因此，甲烷消耗量的缺乏不仅是由于其活动率的变化，同时也是由于甲烷营养菌种群恢复率低所造成的的。甲烷营养菌被分为I型（如Methylococcus和Methylobacte）和II型（如Methylosinus和Methylocystis），并且我们观察到随着年龄的增长从I型转变为II型。总体而言，II型甲烷营养生物占主导地位（占甲烷营养生物的77%），并且时序对其有较大的影响。鉴于甲烷单加氧酶基因丰度在未开采的地点均达到了最高相对丰度，因此它们可能推动了甲烷单加氧酶基因丰度的大部分变化。尽管所有的II型甲烷营养生物都随着年龄的增长而显着增加，但在未开采的地点，它们的相对丰度仍然更高。因此，甲烷营养群落才刚刚开始恢复，可能要花费超过31年的时间才能与未受干扰的森林土壤相媲美。 6 宏基因组与生态系统过程之间的联系 总结 总的来说，本研究描述了生态系统扰乱后土壤基因组的分类学和功能变化，并阐明了扰乱后微生物恢复的可能机制及其潜在的生态意义。微生物类群和功能基因的转变都表明，从不稳定的碳向稳定的碳过渡对驱动微生物代谢变化很重要。资源的过渡可能导致从富营养型群体向寡营养型群体的转变，并增加了微生物之间的竞争。此外，微生物不仅在群落水平上而且在功能组内也显示出连续的模式，例如氨氧化剂内AOB和AOA之间的过渡以及亚硝酸盐氧化菌内Nitrobacter，Nitrospira以及Nitrococcus之间的过渡。丰富的分类单元和功能基因表明，甲烷氧化菌种群的恢复时间非常长，是31年后甲烷降低后森林土壤无法恢复的原因。在两个关键的生物地球化学循环中，宏基因组与生态系统参数之间揭示的不同关系表明，这些循环的复杂性以及观察到的过程速率变化的幅度是确定完整的元基因组数据集与生态系统功能之间广泛关系的限制因素。
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