【原】科研 | SBB: 长期有机改良如何增加土壤磷酸酶活性:了解携带phoD和phoc的功能性微生物种群(国人作品)

微生态 2021-04-13

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编译：Frank，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

在有机物料替代矿物肥料的背景下，了解有机改良剂如何影响土壤胞外磷酸酶活性，从而加速有机磷的矿化十分重要。为解决此问题，本研究从微生物介导的途径研究了有机改良剂对土壤中酸（ACP）和碱性（ALP）磷酸酶活性的影响，以及有机改良剂如何影响这些活性。

本文对来自全球106个已发表研究的599个测量值进行了全面的meta分析，并从30年的施肥田间试验中获得田间数据进行了分析。

① 根据meta分析，与纯矿物施肥相比，有机改良剂使平均胞外ACP和ALP活性分别增加22％和53％。活性的增加与土壤有机碳、总氮和有效磷含量以及微生物量碳和氮的显着增加是一致的。

② 长期现场实验数据表明，在有机改良土壤中，编码ALP的phoD-携带物种与编码ACP的phoC-携带物种更加紧密相关，并且发现更多的网路中心点。

③ 土壤C:P和N:P比以及微生物量C是phoC-和phoD-携带种群的丰度、多样性和组成的主要预测因子。进一步的分析表明，土壤C:P比是潜在ACP和ALP活性的主要预测因子。

本文突出了理解土壤C:N:P化学计量如何介导磷酸酶携带种群的重要性，以确定使用有机改良剂增加磷酸酶活性所带来的结果。

论文ID

原名：Understanding how long-term organic amendments increase soil phosphatase activities: Insight into phoD- and phoC-harboring functional microbial populations

译名：长期有机改良如何增加土壤磷酸酶活性:了解携带phoD和phoc的功能性微生物种群

期刊：Soil Biology and Biochemistry

IF：5.29

发表时间：2019.12

通讯作者：凌宁

作者单位：南京农业大学，江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室，江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心

实验设计

1.Meta分析

搜集2000-2016年之间Google学术和ISI Web of Science上的106篇经过同行评审的文献，将此数据集作为补充。从中确定了599个测量值，这些测量值至少包括两个针对性搜索词：“碱性磷酸酶”、“酸性磷酸酶”或“肥料”、“农场肥料”、“秸秆”、“固体废弃物”、“堆肥”或“废弃物”。根据以下标准提取并数据：

（1）如果仅在图形或图表中显示了相关数据，则使用ImageJ 1.50i提取均值和标准差，使用公式将标准误差转换为SD；

（2）独立检测各个研究中的各种独立的实验；

（3）将文献中最新采样时间点和土壤最上层的数据用作本文的数据库。使用响应比作为衡量标准，比较了有机和纯矿物的肥料中不同响应变量的影响大小。

2.研究地点和土壤采样

中国江西属典型的亚热带季风气候，年降水量为1537毫米，年蒸发量为1100-1200毫米，年平均气温为17.5℃。该地区的土壤来源于第四纪红土，被分类为Ultisols和Oxisols。田间试验开始时的基本理化性质（0-20厘米）如下：

（a）pH为6.00；

（b）土壤有机质10.22 g/kg；

（c）总氮0.78 g/kg ;

（d）总磷0.47 g/kg；

（e）有效磷2.50 mg/kg。

实施了以下四种处理：

（1）对照，不添加肥料；

（2）NPK，纯矿物肥料；

（3）M，纯有机改良剂；

（4）MNPK，化学肥料和有机改良剂联合施用。

3.测定土壤特性和潜在的磷酸酶活性

使用元素分析仪测定土壤中的有机碳和总氮，用0.5 M NaHCO₃提取土壤有效磷，使用抗坏血酸钼酸铵法测定其浓度，用氯仿熏蒸法测定土壤微生物量碳（MBC）和氮（MBN），土壤胞外ACP和ALP的活性通过测量磷酸对硝基苯酯中对硝基苯酚的释放来估算。

4. 土壤DNA提取和qPCR

DNA提取试剂盒：Power Soil® DNA Isolation Kit (Qiagen, Hilden,Germany)，DNA纯化：Wizard DNA Clean-Up System (Axygen Bio, USA)。通过qPCR分析估算phoD和phoC基因拷贝数，25 μL反应体系：12.5 μL的SYBR®Premix Ex Taq（2x），0.5 μL的ROX参考染料II（50x），0.5 μL引物，1 μL模板和10 μL ddH₂O。

5. 携带phoD和phoC微生物的群落特征

通过高通量测序，评估了携带phoD和phoC的微生物群落多样性和组成。使用引物对对phoD和phoC基因进行PCR扩增，以提供相对准确的系统发育和分类学信息。使用TrimGalore软件去除了低质量的序列，使用UCHIME软件对测序数据进行预处理，以从数据集中识别和去除嵌合体，使用Framebot工具将phoD基因的核苷酸序列转换为氨基酸序列，然后与phoD基因数据库匹配。使用Framebot工具，通过从UniProt数据库下载已知的phoC编码氨基酸序列，将phoC基因的核苷酸序列转换为氨基酸序列。来自每个样品的phoD和phoC的序列reads分别以80％和88％的相似性聚类到OTU。通过MUSCLE和iTO分析phoC或phoD编码氨基酸序列与OTU丰度之间的系统发育关系。

6. 统计分析

通过ANOVA分析数据的显着差异，并使用LSD检测来比较每个变量的均值。所有数据均基于偏度和峰度系数以及Q-Q plot检测的可视化进行正态分布。使用R语言的“gplots”和“RColorBrewer”包生成热图，以分析施肥导致的土壤特性变化。使用“vegan”包进行主成分分析，以研究四种处理的土壤中携带phoC或phoD的微生物群落组成的差异。网络分析以研究phoD和phoC群落之间的共现模式。在共现网络内，前5％的那些节点被定义为网路中心点，被认为对介导phoD和phoC携带物种之间共现模式至关重要。随机森林分类分析被用来确定土壤ACP和ALP活性的主要预测因子，随机森林平均预测因子重要性（MPI）用于表征主要预测因子。

结果

1. 有机改良剂对潜在磷酸酶活性的影响

根据来自106个已发表研究的599个测量值的meta分析，与仅使用矿物肥相比，有机改良剂使土壤潜在ACP和ALP活性分别提高了22％和53％。施有机改良剂比单纯施矿物肥的土壤表现出更大的微生物量（MBC增加54％； MBN 31％）以及土壤有机碳（29％）和养分含量（TN19％；有效磷48％）（图1A），这些变量和化学计量比都与ACP和ALP活性具有强相关性（图1B）。对于田间施肥实验，与单纯施矿物肥（NPK）相比，有机改良剂处理组（M和MNPK）土壤的潜在ACP和ALP活性分别增加了345-569％和11-44％（图2A/B）。有机改良土壤表现出不同的土壤碳、氮和磷含量及比例以及微生物量碳和氮及比例的模式。与对照相比，有机改良剂处理的土壤有机碳和总氮含量、有效磷浓度以及微生物量碳和氮较高。

图1.（A）：有机改良剂对土壤胞外磷酸酶活性，微生物量和土壤C:N:P化学计量的平均影响大小。（B）：磷酸酶活性与驱动因素之间关系的网络图。虚线箭头表示贡献系数小于0.2，箭头上方的数字表示样本量，箭头的粗细表示关系的大小。星号表示显著性 p<0.05，p<0.01和p <0.001分别为*、**和***。缩写：酸（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）；微生物生物量C（MBC）和N（MBN）; 土壤有机碳（SOC）；总氮（TN）; 有效磷（AP）。

图 2. （A-C）：潜在的碱性磷酸酶（ALP）活性，通过基因拷贝数估算的phoD基因的丰度以及通过Shannon指数估算的携带phoD的群落的多样性。（D-F）：潜在酸性磷酸酶（ACP）的活性，phoC的丰度和携带phoC的群落的多样性。

2. 有机改良剂对携带phoD和phoC微生物的影响

phoD基因丰度的变化趋势与土壤ALP活性相似，在M处理中丰度最高，其次是MNPK（图2C）。PhoC基因丰度在不同处理组间没有差异（图2D）。然而，尽管phoD多样性保持不变，但是在处理组之间携带phoC微生物的多样性存在显着差异（图2E–F）。PCA分析表明携带phoD和phoC微生物群落的组成存在明显差异。进化树图说明phoC或phoD编码基因的氨基酸序列与OTU丰度的系统关系（图3）。具有高度相似性的氨基酸序列可以由不同的phoD-或phoC-携带物种（OTU）编码。但是，任何一个OTU也可以编码不同的氨基酸序列（图3）。在携带phoD微生物中，优势菌门是放线菌门（相对丰度为77-92％）、浮霉菌门（4-8％）和厚壁菌门（2-6％），优势菌属包括链霉菌属、拟诺卡氏菌属、小单孢菌属和芽孢杆菌属等（图3A）。携带phoC微生物中，优势菌门是变形菌门（58-88％）、拟杆菌门（3-19％）和放线菌门（1-7％），优势菌属为交替赤杆菌属、Pricia、Desulfoluna和包西氏菌属（图3B）。

图3.：进化树图描述phoD（A）和phoC（B）编码氨基酸序列与OTU丰度（平均相关丰度> 0.05％）之间的系统发育关系。

3. 携带phoD和phoC微生物群落之间的共现

根据土壤属性的变化，将处理组分为两类，即有机组（M和MNPK）和非有机组（对照和NPK）。通过Dufrene-Legendre分析确定指示种，以鉴定与特定处理相关的OTU（图4）。在这些指示种中，选择了主要的OTU（基于相对丰度），并根据其分类进一步分析。使用网络分析确定了phoD-和phoC-携带类群的共现模式。无论何种处理，观察到正相关性大于负相关性（图5）。有机改良剂处理组与对照组相比，PhoD-携带物种与phoC-携带物种之间的联系更加紧密（图5）。在有机改良剂处理组发现19个网路中心点，OTU141（phoC，黄单胞菌属）比其他网路中心点更大，被认为是关键分类群。同样，在对照组中发现15个网路中心点，OTU7（phoC，黄单胞菌属）被认为是关键分类群（图5）。在这些网路中心点中，选择Top10进一步分析。选择的特定OTU既是物种指标，也是有机和非有机处理土壤中的网路中心点。在有机改良剂处理组中，确定了其中三个OTU，分别属于新鞘脂菌属、黄单胞菌属和交替赤杆菌属。在对照中，确定了五个OTU，分别与δ-变形菌、脱硫小杆菌属和黄单胞菌属有关。

图4. 由Dfrene Legendre分析确定的指标物种，用于鉴定与有机改良土壤（M和MNPK）和对照（对照和NPK）特异性相关的OTU。

图5. phoD-和phoC-携带微生物群之间的共现网络。蓝色边缘表示两个单独节点之间的正向交互作用，红色边缘表示负向交互作用。蓝色的节点表示属于phoD基因的OTU，红色的节点表示属于phoC的OTU。

4. 胞外磷酸酶活性的可靠预测因子

随机森林模型表明，在预测携带phoD微生物的丰度方面，微生物量C表现出较高的随机森林MPI（26％），其次是土壤C:P比（25％）（图6 A）。根据随机森林分析，土壤C:P比（26％）是phoD-携带微生物群组成的主要预测指标，其次是土壤N:P比（24％）和微生物量C:N比（23％）（图6B）。进一步确定ALP活性的最可靠预测指标发现，土壤C:P比显示最高的MPI（26％），其次是微生物生物量C（25％），phoD-携带群落的丰度（24％）和组成（23％）（图 6C）。与phoD基因相似，土壤C:P和N:P比以及微生物量C也被确定为phoC-携带微生物群落多样性和组成的主要预测因子（图6 D和E）。进一步确定ACP活性的最可靠预测指标发现，土壤C:P比显示出最高的MPI（25％），其次是phoC-携带群的多样性（23％）和组成（23％），微生物量C:N比（23％）（图6 F）。