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编译：陈佩佩，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 肠道微生物与影响人类的主要疾病有关，也与人体循环中的甘油三酯和高密度脂蛋白水平有关。而代谢组学的最新发展能够对脂蛋白颗粒进行更细致的研究。 本文研究了来自鹿特丹研究中心和LifeLines-DEEP项目中的2309个体的肠道微生物群对循环代谢物（通过核磁共振技术检测）的影响。通过线性回归分析评估肠道微生物群与代谢物之间的关系，同时调整了年龄、性别、体重指数、技术变量、药物使用和多重测试。 研究发现了32个微生物科和属与极低密度和高密度亚组分、血脂测定、糖酵解相关代谢物、酮体、氨基酸和急性期反应标记物的关联。这些研究结果为深入了解微生物群在宿主代谢中的作用以及支持肠道微生物群作为治疗和预防干预目标的潜力提供了依据。 论文ID 原名：Relationship betweengut microbiota and circulating metabolites in population-based cohorts 译名：人群中肠道菌群与循环代谢产物的关系 期刊：Nature Communications IF：11.878 发表时间：2019年12月20日 通讯作者：Cornelia M. van Duijn 作者单位：荷兰鹿特丹大学医学中心 实验设计 1、 代谢物分析 在两项参与研究中，使用1H-NMR技术对空腹血浆样品中的小化合物进行定量。同时利用代谢组学平台对多种代谢物进行同时定量，包括氨基酸、糖酵解相关代谢物、酮体、脂肪酸、常规脂质和脂蛋白亚类。在整个参与的研究中，总共有145个未经验证的代谢物测量值以绝对浓度单位量化。 2、肠道菌群分析 按要求收集参与者粪便样品，并利用16SrRNA基因的V3和V4可变区用319F（AccTCAGGGGAGCGAGCAG）—FI806（RGACTATCHVGGTWTCTAAT）引物对扩增，并在IlluminaMISEQ测序仪（MISEQ试剂盒V3，2×300 bp）5上进行双索引和测序。微生物Shannon多样性指数是在R中使用vegan包(https://www./)。 3、统计分析 使用R中的R meta包（https://cran.R-project.org/web/packages/rmeta/index.html，https://www.R-project.org/）逆方差加权分析合并参与研究的汇总统计。共有145个重叠代谢物测定和345个重叠微生物类群在科属分类水平上进行了关联性检验。这些微生物类群至少存在于三个样品中。由于代谢组学和肠道微生物群数据集的测量结果高度相关，使用文献的方法计算了一些独立的测试。代谢产物测定中有37项独立试验，微生物类群中有274项独立试验。因此，显著性阈值设置为0.05/（37×274）= 4.93×10-6。 在每项参与研究中，在调整年龄、性别、体重指数、技术协变量和药物使用（降脂药物、蛋白泵抑制剂和二甲双胍）的同时，还通过线性回归分析评估了代谢物与微生物多样性之间的关系，并将汇总的统计结果与反向分析相结合R中使用R meta包的方差加权固定效应meta分析。 结果 1、目标研究人群 研究个体来自鹿特丹研究和LifeLines-DEEP项目。鹿特丹研究是一项基于人群的前瞻性队列研究，始于1990年，研究对象来自定义明确的鹿特丹地区，而LifeLines-DEEP项目是位于荷兰北部，从2006年建立的一项基于人群的前瞻性队列研究。鹿特丹研究的参与者（n=1390，平均年56.9 ± 5.9，57.5%为女性）比LifeLines-DEEP项目的参与者（n=915，平均年龄44 ± 13.9，58.7%为女性）年长，而两个研究队列的性别分布是可比的。 2、肠道微生物群与循环代谢产物的关系 循环代谢物与肠道微生物群组成之间的关联分析结果如图1所示。经年龄、性别、体重指数（BMI）、药物使用（包括降脂药物、蛋白泵抑制剂和二甲双胍）、技术变量和多重试验调整后，共有32个与各种循环代谢物相关的微生物科或属（图1）。分析中校正的变量是根据以前的文献结果选择，多重检验校正包括Bonferroni校正，通过方法计算的代谢组学和肠道微生物群数据集中的独立检验次数（0.05/（37个独立代谢物测量×274个独立微生物分类 = 4.93×10-6）。在对吸烟和饮酒量进行额外调整后，观察到类似的关联模式（图1b）。整个队列的效应大小方向大体一致。 研究检测到18个微生物科或属和各种大小的极低密度（VLDL）颗粒（超小、小、中、大、非常大和非常大）以及22个微生物科或属和HDL颗粒（小、中、大和非常大）之间存在显著的关联。据报道极低密度脂蛋白颗粒分布异常与代谢性疾病病因、心血管疾病和2型糖尿病相关，而与疾病风险相关的是非常大大、大HDL颗粒和中、小HDL颗粒的逆相关。有13个微生物科和属与极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒亚类有关。例如，Christensenellaceae和Christensenellaceae R7群属、Ruminococcaceae（UCG-005、UCG-003、UCG-002和UCG-010）、Marvinbryantia和Lachnospiraceae FCS020群被发现与各种大小的VLDL颗粒、小HDL颗粒和中等HDL颗粒中的甘油三酯有关，而Clostridiaceae1和Clostridium sensu stricto 1又与非常大和很大的HDL颗粒有关（图1b）。这些微生物类群之间的相关分析表明，Christensenellaceae, ChristensenellaceaeR7 group, 和 Ruminococcaceae与Ruminococcaceae之间的正相关（ρ从0.32到0.67），与Ruminococcaceae之间的正相关（ρ从0.46到0.77）。这些相关性与之前的研究结果相同。以前的研究发现Christensenellaceae与BMI有关，Marvinbryantia与肠功能失调相关，而clostridiace1则参与胆汁酸代谢，类似于BMI。值得注意的是，与中小型高密度脂蛋白的缔合模式相比，与非常大和非常大的高密度脂蛋白颗粒的缔合模式相反，包括颗粒浓度及其总脂质、胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯（图1）。 此外，本研究还证实了先前报道的血清甘油三酯与Ruminococcaceae（一种与低肠道微生物丰富度相关的肠道微生物）的关联。有15个与血清甘油三酯相关的微生物科和属（图1）。血清甘油三酯与小极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白、中高密度脂蛋白和中极低密度脂蛋白胆固醇酯聚集的关联模式（图2）。在15个与血清甘油三酯相关的微生物科属中，有3个微生物类群也与极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒相关，9个与极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒相关（图3）。 本研究还确定了Lachnospiraceae及其属Blautia与小HDL颗粒之间的关联（图1b）。Lachnospiraceae是人类肠道微生物群的主要分类群之一，其属与维持肠道健康有关，Blautia属与肥胖有关，据报道参与了初级胆汁酸向次级胆汁酸的转化。Lachnospiraceae与该科Blautia属的相关系数为0.82。Clostridiaceae1和Clostridium sensu stricto 1与HDL和VLDL颗粒的直径有关（图1b）。VLDL直径与Christensenellaceae、Christenellaceae R7群和Ruminococaceae UCG-002属进一步相关。有趣的是，高密度脂蛋白颗粒的直径与心血管疾病有关。 除脂蛋白组分外，6个微生物科和属与脂肪酸相关，包括单不饱和脂肪酸（MUFA）、饱和脂肪酸（SFA）和总脂肪酸（TotFA），而8个微生物科和属与其他3种代谢产物相关，包括酮体醋酸酯、氨基酸异亮氨酸，急性期反应标志物糖蛋白乙酰（主要是α1）（图1b）。Ruminococaceae UCG-005属与乙酸盐有关，而Clostridiaceae1、Clostridium sensu stricto 1和RuminococaceaeUCG-014属与异亮氨酸有关。有趣的是，7个微生物科和属与糖蛋白乙酰基水平相关，并与其他常见的感染标志物有关，及与感染性疾病和癌症有关。据报道，包括Blautia属在内的Ruminococcaceae和Lachnospiraceae参与了初级胆汁酸转化为次级胆汁酸和/或短链脂肪酸（SCFAs）的生产。 3、微生物多样性与循环代谢产物的关系 接下来确定肠道微生物群的微生物多样性是否与脂蛋白颗粒或其他代谢物有关（图4）。当调整多重测试和年龄、性别、体重指数和药物使用时，出现的模式是，较高的微生物群多样性与较低水平的VLDL颗粒（小、大、中、非常大和超大）、血清甘油三酯、TotFA、MUFA和SFA显著相关，大的和超大的高密度脂蛋白颗粒含量增加，高密度脂蛋白直径增大（图4）。至于其他代谢物，较高的微生物群多样性与较低水平的糖蛋白乙酰基、丙氨酸、异亮氨酸和乳酸显著相关（图2）。极低密度脂蛋白颗粒中甘油三酯的相关性最强（p = 8.48×10-10）。 讨论 本文利用1H-NMR技术检测了来自鹿特丹研究和LifeLines-DEEP项目的2309名个体的肠道微生物群对宿主循环代谢物的影响。确定了肠道微生物群组成与各种代谢物之间的关联，包括特定的VLDL和HDL脂蛋白亚组分；血脂测量，包括甘油三酯和脂肪酸；糖酵解相关代谢物，包括乳酸；酮体，包括醋酸盐；氨基酸，包括丙氨酸和异亮氨酸；急性期反应标志物，包括与年龄、性别、体重指数和药物使用无关的糖蛋白乙酰基。除1H-NMR测定的低密度脂蛋白和葡萄糖水平中的甘油三酯外，未发现与低密度脂蛋白亚组分相关。 基于两项大规模人群研究的结果确定了肠道微生物群组成与各种脂蛋白颗粒之间的关联。观察到Christensenellaceae与不同大小的极低密度脂蛋白颗粒、小的高密度脂蛋白颗粒和中等高密度脂蛋白中的甘油三酯呈反比关系（图1b）。Christensenellaceae先前研究与BMI相关，并且与小鼠研究中报告的体重增加减少相关，在该研究中，无菌小鼠接种瘦肉型和肥胖型人类粪便样本。 有趣的是，肠道微生物群的组成显示与不同大小的极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒相关，然而，低密度脂蛋白和低密度脂蛋白颗粒的相关性较弱，这表明肠道微生物群影响不同种类的脂蛋白。虽然不同大小的极低密度脂蛋白颗粒显示出相同的缔合模式，但大、中、小HDL颗粒之间的差异表明它们是异质结构。小的高密度脂蛋白颗粒密度高，蛋白质含量高，脂质含量低，而大的高密度脂蛋白颗粒密度大，脂质含量低。尽管高密度脂蛋白始终与降低心血管疾病风险相关，但在过去十年中，高密度脂蛋白干预的临床相关性出现了重大争议。大多数旨在提高高密度脂蛋白水平的试验都没有成功，甚至因为不良反应而停止。HDL类的异质性早就被认识到，但现在可以进行大规模的评估。如前所述，高密度脂蛋白的这种成分异质性导致功能异质性，使得小的和大的高密度脂蛋白颗粒呈负相关，并与包括心血管疾病在内的各种疾病呈负相关。正如在本研究中发现的，小HDL颗粒与Blautia属和Lachnospiraceae有关，且具有较低的多样性。事实上，小脂蛋白颗粒浓度的高水平以前与中风风险的增加有关，而与Clostridiacae1, Clostridium sensu stricto1和未知科属相关的大的和超大的HDL颗粒，与心血管疾病和中风风险降低相关。有趣的是，Clostridiacae1以前研究与BMI、血清甘油三酯呈负相关，并且已知与胆汁酸代谢有关。 此外，本研究还证实了Ruminococcus gnavusgroup与血清甘油三酯水平的关系。Gnavus与Lachnospiraceae正相关，与Ruminococcaceae负相关，这与早期误分类为Lachnospiraceae有关。与血清甘油三酯相关的微生物类群也与其他脂蛋白颗粒相关（图2）。然而，本研究也观察到与VLDL（两个微生物属）、HDL（九个微生物属和科）和LDL颗粒（一个属）完全相关的微生物类群，这表明脂蛋白颗粒是重要的，而不仅仅是循环甘油三酯的溢出效应。 除了循环脂质和脂蛋白颗粒外，肠道微生物群和酮体（包括乙酸盐）、氨基酸（包括异亮氨酸）和急性期反应标记物（包括糖蛋白乙酰基，主要是α1）之间也存在关联。醋酸循环水平与Ruminococcaceae UCG-005有明确关系。此外，异亮氨酸与Christensenellaceae和微生物多样性呈负相关，与Blautia呈正相关。尽管观察到异亮氨酸与这些分类群之间的关联模式相同，但关联并未达到显著性阈值。然而，粪便和血液中的代谢物浓度可能不同。这是未来研究的一个重要领域。 肠道微生物群影响循环脂质水平的潜在机制可能涉及胆汁酸和超临界脂肪酸。在我们的研究中发现的一些微生物类群参与了一级胆汁酸到二级胆汁酸的转化和SCFAs的产生。先前的研究表明，细菌源性胆汁酸吸收到血液中可以调节肝脏和/或全身的脂质和葡萄糖代谢。循环脂质水平与微生物类群之间联系的生物学基础的另一个潜在部分可能是通过SCFAs。丁酸、丙酸、乙酸乙酯等SCFAs可影响脂质生物合成，起重要的能量来源，调节脂肪酸和氧化应激。 本研究还证实了微生物多样性和血清甘油三酯的相关性，并提供了与高密度脂蛋白颗粒相关的见解。先前的研究报道了微生物多样性与高密度脂蛋白之间的正相关，然而，对脂蛋白亚组分的进一步分析显示，大的和超大的高密度脂蛋白颗粒与微生物多样性呈正相关，而中、小的高密度脂蛋白颗粒呈负相关。在自身免疫性疾病、肥胖和心脏代谢疾病中发现了较低的微生物多样性。 总之，本研究发现肠道微生物群组成与各种循环代谢物之间的联系，包括脂蛋白亚组分、血脂测定、糖酵解相关代谢物、酮体、氨基酸和急性期反应标记物。肠道微生物群与VLDL和HDL颗粒的特定脂蛋白亚组分之间的关联，为深入了解微生物群在降低宿主脂质水平中的作用提供了依据。这些观察结果支持了肠道微生物群作为治疗和预防干预目标的潜力。 评论 该研究的优势在于大样本、基于人群的研究设计和参与研究的协调分析，同时校正药物使用和BMI等因素。结合两项大规模的基于人群的研究数据，可以提高研究的统计能力，并对研究结果的一致性进行内部交叉检查。然而，本研究也有局限性。在探索循环分子时，将重点放在核磁平台所测量的代谢物上，该平台覆盖了广泛的循环化合物。然而，这些化合物在循环代谢物中所占比例有限，因此，今后的研究应侧重于通过其他更详细的技术检测到的代谢物。此外，从粪便样本中测定肠道微生物组成。由于肠道微生物的组成在整个肠道内的解剖位置和给定的位置上各不相同，未来可以通过从肠道的不同位置获取样本来获得肠道微生物群的更完整的图谱。此外，在探索肠道微生物群时，可利用16S rRNA测序。尽管16S rRNA可以捕捉到群落多样性的广泛变化，但亚基因组方法提供了更好的分辨率和敏感性。此外，本研究的横截面性质未能跟踪每个个体的变化。今后的研究应侧重于收集粪便和血样，以评估纵向变化。
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