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编译：茜茜，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 论文ID 原名：Intestinal dysbiosis augments liver disease progression via NLRP3 in a murine model of primary sclerosing cholangitis 译名：原发性硬化性胆管炎小鼠模型中肠道失调通过NLRP3促进肝脏疾病进展 期刊：Hepatology IF：14.971 发表时间：2019.2.10 通讯作者：lijun liao, Kai Markus Schneide 作者单位：比亚琛工业大学内三科 结果 1. Mdr2缺乏会导致淤胆性肝损伤，并引发细胞凋亡 结果发现，Mdr2−/−小鼠在8周和52周时血清转氨酶（ALT）水平显著升高，显示严重的肝脏损伤。与WT小鼠相比，Mdr2−/−小鼠显示出更高的肝脏与体重比率。此外，Mdr2−/−小鼠血清胆汁酸浓度显著升高。胆汁酸的合成是哺乳动物胆固醇分解代谢的主要途径；在Mdr2−/−小鼠中，血清胆固醇水平明显降低。Mdr2−/−小鼠的肝脏组织学表现为随着时间的推移(52周)出现强烈的慢性胆管周围炎症反应、进行性胆管增生和门脉周围纤维化。这些数据显示Mdr2−/−肝脏的炎症增加，从而刺激了PSC样表型的进展。 胆汁酸的积聚，特别是那些具有疏水性的胆汁酸，会触发胆汁淤积进而诱导肝细胞死亡。Western blot结果显示Mdr2−/−小鼠肝脏显示明显更高的cleaved caspase-3和caspase-8表达。并且，Mdr2−/−小鼠肝中caspase-3的细胞数量显著增加。受体相互作用蛋白激酶3(RIP3/RIPK3)已经成为程序性坏死下垂的重要调节因子。因此，我们检测了RIP1和RIP3蛋白在Mdr2−/−肝脏中的表达。与WT肝相比，Mdr2−/−中RIP3蛋白的低表达，而RIP1的表达略有上调。这些结果提示Mdr2−/−小鼠的肝损伤可能是由细胞凋亡介导的。接下来研究caspase-8在Mdr2−/−肝脏中被强烈激活后它，在疾病进展中的作用。我们将Mdr2−/−小鼠与Casp8∆HepA小鼠杂交，获得Mdr2−/−/Casp8∆HepA动物。与雄性Mdr2−/−小鼠相比，Mdr2−/−/Casp8∆−/−小鼠在12周和26周龄时的转氨酶水平没有显著差异。这些结果表明，肝细胞中的caspase-8在Mdr2−/−肝脏的疾病进展过程中是必不可少的，尽管它有很强的激活作用。 图1 MDR2缺乏会导致淤胆性肝损伤，并引发细胞凋亡 (A)8周龄和52周龄Mdr2−/−小鼠和WT小鼠的血清ALT和AP水平(n=12-15)。(B)测定8周龄Mdr2−/−小鼠和WT小鼠的血清胆汁酸浓度(n=6)。(C)经H&E染色后的代表性肝脏切片。(D)用Western blot方法检测8周龄Mdr2−/−和WT小鼠肝脏中cleaved-caspase3和cleaved-caspase8的蛋白水平。(E)caspase3和caspase8蛋白水平定量(n=3~6)。(F)对Mdr2−/−和WT小鼠8周龄和52周龄的肝脏进行cleaved-caspase3免疫组织化学染色。红色箭头表示激活了caspase-3的细胞。(G)测定各组小鼠各时间点cleaced-caspase-3活化的细胞数(n=6~8)。(H)用免疫印迹法检测Mdr2−/−和WT小鼠8周龄和52周龄肝脏中RIP1和RIP3的蛋白水平。(I)测定Mdr2−/−/Casp8f/f和Mdr2−/−/Casp8∆HepA小鼠12周龄和26周龄血清ALT水平。Western blot分析采用GAPDH作为载量对照。 2 NLRP3炎症小体在PSC和Mdr2−/−肝脏中被激活 炎症小体是激活caspase-1的细胞内信号平台，炎症小体NLRP3与多种肝病有关。为了研究NLRP3与PSC的相关性，对PSC患者和健康对照组的人肝切片进行NLRP3染色。结果发现，PSC患者的IHC显著升高，IL-1β阳性细胞提示炎症小体激活。8周龄和52周龄Mdr2−/−小鼠肝免疫组化显示NLRP3阳性细胞明显增多。此外，在肝组织中发现了NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β的蛋白过表达，这与这些肝脏样本中NLRP3、IL-1β、Asc、Caspase-1和Caspase-11的基因表达水平较高一致。这些结果表明Mdr2−/−小鼠的胆汁淤积性肝损伤是由显著的炎性小体激活介导的。 图2 NLRP3炎症小体在PSC和Mdr2−/−肝脏中被激活 (A)与正常对照组(n=5)相比，11例原发性肝癌患者的肝脏门静脉周围有较多的NLRP3和IL-1β阳性细胞。(B)由委员会认证的肝脏病理学家进行免疫组化染色的NLRP3和IL-1β强度评分。(C)石蜡切片上有代表性的NLRP3免疫组化染色。红色箭头表示NLRP3阳性细胞。(D)对各组小鼠各时间点的NLRP3阳性细胞进行定量分析。(E和F)免疫印迹法检测NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β蛋白水平和蛋白定量。以GAPDH作为载药对照。(G)RT-PCR法检测肝组织中NlLRP3、IL-1β、Asc、Caspase-1和Caspase-11的mRNA表达。 3 Mdr2−/−小鼠的肠道微生物菌群组成发生了变化 在Mdr2−/−小鼠中，我们发现血清胆汁酸成分发生变化。由于胆汁酸代谢的改变可能会影响肠肝循环，从而改变微生物区系组成，因此我们研究Mdr2−/−小鼠是否表现出肠道生物失调。NMDS分析显示52周龄的Mdr2−/−和WT鼠的盲肠内容物有明显的分离。基于ADONIS粉刺，CAGE的微生物区系总变异性高达34%。与WT小鼠相比，Mdr2−/−小鼠的微生物物种多样性降低。LEfSe分析显示，Lachnospiraceae科在WT和Mdr2−/−之间存在明显差异。有趣的是，Lachnospiraceae与人PSC有关联，其特征是产生异胆汁酸，这表明观察到的胆汁酸成分的变化可能影响微生物胆汁酸的代谢。这些数据表明Mdr2−/−小鼠的慢性肠道疾病导致肠道微生物区系组成显著改变，并导致特定的微生物区系特征。 图3 Mdr2−/−小鼠的肠道微生物区系组成发生了变化 (A)基Bray-Curtis差异的NMDS图谱显示Mdr2−/−和WT小鼠明显分离。(B)基于Adonis的条形图，显示了由“genotype”、“litter”和“cage”因素的肠道微生物区系的变异性百分比。(C)Mdr2−/−和WT小鼠的微生物区系α多样性表现物种丰富。(D)LEFSE分析确定乳螺旋科分类群在Mdr2−/−(红色)和WT(蓝色)小鼠中存在差异调节。 4 Mdr2−/−缺失导致肠屏障破坏 由于Mdr2基因缺失导致肠屏障功能紊乱，肠道菌群失调可能导致肠屏障功能改变。因此，我们对肠道上皮进行了研究。上皮紧密连接维持肠屏障，其中ZO-1是一种支架蛋白，在紧密连接的形成中起着关键作用。 Mdr2−/−小鼠结肠和回肠ZO-1蛋白和基因表达在不同时间点均明显降低。免疫染色进一步证实ZO-1在 Mdr2−/−小鼠肠绒毛上皮中表达下调。此外，在 Mdr2−/−小鼠的结肠中，小鼠粘液层完整性受到干扰，与WT小鼠相比，粘液明显变薄。为了研究紧密连接表达和粘液层的减少是否转化为通透性的增加，我们用FITC-葡聚糖灌胃 Mdr2−/−和WT小鼠。WT小鼠在给药4小时后血清FITC-葡聚糖水平非常低，而Mdr2−/−小鼠血清中FITC-葡聚糖浓度显著升高。通过测定门静脉血中脂多糖(LPS)浓度进一步证实通透性增加。并且，Mdr2−/−小鼠的肝脏中总细菌和肠杆菌科的基因的相对丰度显著高于WT小鼠。此外，在52周的时间点，所有Mdr2−/−肝中都能检测到肠球菌rRNA基因，而在所有WT对照组小鼠中都检测不到肠球菌基因。因此，这些数据显示Mdr2−/−小鼠的屏障功能受损。 图4 Mdr2缺失导致肠屏障破坏 8周龄和52周龄Mdr2−/−和WT小鼠的结肠和回肠被纳入分析(A-D)。 (A)用Western blot分析结肠和回肠组织标本中ZO-1蛋白的表达。以GAPDH作为载药对照。(2)采用qRT-PCR方法检测ZO-1在结肠和回肠组织中的基因表达水平。(C)冷冻结肠和回肠切片进行代表性ZO-1免疫荧光染色。(D)结肠切片的MUC2免疫荧光染色。(E)测定8周龄Mdr2−/−和WT小鼠肠道对FITC-葡聚糖的通透性。(F)测定8周龄Mdr2−/−和WT小鼠门静脉内毒素浓度。(G)提取肝组织DNA，用qPCR方法测定细菌总数、肠杆菌科和肠球菌细菌16S核糖体RNA基因的相对丰度。 5 Mdr2缺失会激活肠道中的炎症体信号 由于Mdr2−/−肝脏中炎性小体的激活增加，下一步研究NLRP3的激活是否也参与肠道表型的介导。与WT小鼠相比，8周和52周的Mdr2−/−小鼠的结肠和回肠切片中显示出显著更高的NLRP3阳性细胞。与Mdr2−/−小鼠结肠和回肠中较高的NLRP3基因表达一致。此外，在Mdr2−/−小鼠的结肠中发现NLRP3、Pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达增加，RT-PCR分析显示Asc和Caspase-1基因明显上调。这些数据表明Mdr2−/−小鼠肠道中NLRP3型炎症小体的激活与肝病的进展有关。 图5.Mdr2−/−小鼠肠道内NLRP3型炎症小体被激活 (A)NLRP3免疫组织化学染色。红色箭头表示NLRP3阳性细胞。(2)采用qRT-PCR方法检测NLRP3在结肠和回肠中的表达。(C)对大鼠结肠进行NLRP3、pro-IL-1β和IL-1β的Western blot分析。(D)采用RTPCR方法检测ASC和caspase-1在结肠和回肠中的基因表达。 6 Mdr2−/−微生物菌群转移可诱导健康WT小鼠肠道菌群失调 因为Mdr2−/−小鼠肠道微生物区系组成的改变与NLRP3炎性小体激活和肠道屏障完整性丧失有关，因此我们进一步研究Mdr2−/−微生物菌群对肠道内环境稳定的影响。为此，将Mdr2−/−或WT对照小鼠，通过粪菌移植转移到健康WT小鼠中，为期1周。结果发现，粪菌移植Mdr2−/−导致受体WT小鼠ALT和AST显著增加，表明肝损伤增加。这种表型是由受体WTFMT(Mdr2−/−)小鼠结肠和肝脏中明显的NLRP3炎性小体激活介导的。并且粪菌移植后抑制WT(FMTMdr2−/−)小鼠体内ZO-1蛋白的表达。有趣的是，移植Mdr2−/−微生物诱导了受体WT小鼠细菌群落结构的显著变化。比较WTFMT(Mdr2−/−)第0天和第7天，DESeq分析的差异基因表达分析显示，共有12个细菌组显著上调，8个细菌组下调。三个不同调控的OTU是Lachnospiraceae的一部分，我们在WTFMT(Mdr2−/−)小鼠中观察到Bacteroidales S24-7组的扩张，这可能具有致菌潜力。相反，在WTFMT(WT)中仅观察到三个组的微小变化，均属于乳杆菌科(Lactobacillus)。这些数据表明，在Mdr2−/−小鼠中观察到的肠道生物失调可通FMT传播，并导致炎症性肝病。 图6.粪菌移植Mdr2−/−菌群可以诱导健康WT小鼠肠道菌群失调 (A)WT和Mdr2−/−小鼠每隔一天灌胃一次，共1周。(B)测定血清ALT、AST水平。(C)小鼠结肠和肝脏中NLRP3、Pro-IL-1β，IL-1β和Caspase-1蛋白的表达。(D和E)ZO-1在正常和菌群移植的WT和Mdr2−/−小鼠中回肠的用蛋白定量。(F)WTFMT(WT)和WTFMT(Mdr2−/−)小鼠灌胃FITC-葡聚糖4小时后测定血清FITC-葡聚糖浓度。(G)显示肝脏中MoMFs(定义为Ly6G-、CD11bhi、F4/80+)相对丰富的流式细胞仪数据。(H和I))DESEQ分析比较WTFMT(Mdr2−/−)和)WTFMT(WT)小鼠在第一次转移前(第0天)到转移后(第7天)的微生物菌群结构变化。 7 Pan-caspase抑制剂IDN-7314治疗可改善Mdr2−/−小鼠的肝损伤 在Mdr2−/−肝脏中，我们发现不同的caspase蛋白酶被激活，虽然肝细胞中caspase-8的缺失不能改变表型，但我们发现caspase-1和NLRP3被强烈的激活。因此，我们选用用Pan-caspase的抑制剂IDN-7314，在Mdr2−/−小鼠中用IDN-7314治疗后血清参数显示，肝损伤显著减轻。此外，H&E染色显示，与阳性对照相比，IDN-7314处理的Mdr2−/−肝的门脉周围炎症减轻，胆管增生降低。这些变化与Mdr2−/−小鼠经IDN-7314治疗后血清胆汁酸浓度显著降低有关。为了检测IDN-7314对caspase的抑制作用，接着研究了caspase-8的活性。免疫组化染色和免疫印迹分析显示，IDN-7314处理后Mdr2−/−肝组织中caspase-8的表达明显降低。并且，经IDN-7314处理后，Mdr2−/−肝中Cleaved-caspase-3蛋白表达和caspase-3酶活性显著降低。 图7 IDN-7314治疗可改善Mdr2−/−小鼠的肝损伤 (A)通过血清生化指标(AST、ALT、AP、GLDH)测定肝损伤程度。(B)H&E染色的肝脏石蜡切片。(C)测定血清总胆汁酸、β-MCA、DCA和牛磺酸TbMCA浓度。(D)肝石蜡切片上Cleaved-caspase-8免疫组织化学染色和定量。(E)通过Western blot分析IDN-7314和阳性对照处理的Mdr2−/−和WT肝组织中Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-3的蛋白水平。(F)对WT和Mdr2−/−小鼠肝脏中Caspase-3酶活性进行了分析，比较了Idn-7314处理前后小鼠肝脏中Caspase-3酶活性的变化。 8.IDN-7314治疗重塑Mdr2−/−肝脏微生物菌群并抑制炎性小体激活 使用IDN-7314处理后，结果发现显著改变Mdr2−/−肝脏的微生物菌群，抑制炎症小体的激活，降低血清胆汁酸浓度。接下来，我们分析了IDN-7314治疗对分离52周大的Mdr2−/−和WT小鼠的细菌的影响。乳旋菌科(Otu2)最初在Mdr2−/−中过度膨胀，与WT相比经IDN-7314处理后显著减少。这些结果表明抑制caspase可以重塑在Mdr2−/−小鼠中发现微生物菌群失调来调节肠道-肝脏串扰。并且，通过ZO-1蛋白印迹显示，通过抑制caspase可改善Mdr2−/−小鼠的肠道屏障完整性。由于肠道生物失调可导致肝脏炎性小体激活，我们的研究结果显示，在Mdr2−/−小鼠中，随着疾病的进展，炎性小体表达增强，因此我们研究了IDN-7314治疗对炎性小体激活的影响。Western blot分析显示，IDN-7314治疗后Mdr2−/−小鼠结肠和肝脏中NLRP3、Pro-IL-1β、IL-1β和Caspase-1的蛋白地表达，并且IDN-7314给药后，于对照组相比NLRP3、Asc、IL-1β和Caspase-1、F4/80、IL-6的基因表达水平明显降低。综上所述，这些结果表明caspase的激活显著促进了Mdr2−/−小鼠的疾病进展，并提示NLRP3型炎症小体的激活在这一过程中起着重要作用。 图8 IDN-7314治疗可抑制Mdr2−/−小鼠的炎性小体激活 (A)IDN-7314处理Mdr2−/−小鼠后，与安慰剂处理相比，沙棘科小鼠的OTU_2显著降低。(B)基于Bray-Curtis相异度的主坐标分析图显示，在使用和不使用IDN-7314处理的情况下，Mdr2−/−产仔小鼠是分开的。R中的椭圆是在0.95置信水平下使用多元t分布计算的。(C和D)Western blot分析和量检测IDN-7314或安慰剂处理组小鼠结肠中ZO-1蛋白的表达。(E和F)用Western blot分析IDN7314和载体处理的Mdr2−/−、WT肝和结肠的NLRP3、Pro-IL-1β、IL-1β和Caspase-1的表达。以GAPDH作为载药对照。(G)RT-PCR检测肝组织中NLRP3、IL-1β、Asc、Caspase-1、F4/80和IL-6mRNA在IDN7314、Mdr2−/−和WT肝组织中的表达。 讨论 Mdr2−/−小鼠被认为可以模拟PSC的动物。在这个模型中，磷脂转运蛋白Mdr2，也被称为abcb4的丢失，触发了胆汁淤积反应，导致以胆汁纤维化为特征的肝内硬化性胆管炎。在这里，我们调查了导致肝脏炎症和损伤的途径，以确定新的分子靶点，这可能也与人PSC相关。大约80%的PSC患者患有IBD(尤其是溃疡性结肠炎，但也有克罗恩病)，高达8%的IBD患者也患有PSC。有趣的是，IBD和PSC患者往往有更多的进展性肝病。相反，由于PSC而接受肝移植的患者通常患有更严重的IBD。虽然阳性的家族史和男性性别是PSC的公认风险因素，越来越多的证据表明肠道微生物菌群在疾病发病中的作用。在PSC中，几项研究表明，与健康对照组相比，肠道α多样性降低，总体微生物菌群组成发生显著变化。微生物菌群在肠肝轴中的生物学相关性和致病作用尚不完全清楚。
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