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编译：I AM Spring，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读好氧甲烷氧化-反硝化(AME-D)是全球甲烷循环和氮循环的重要过程。这篇简短的综述更新了关于好氧甲烷氧化菌和反硝化菌的发现，重点介绍了微生物的作用机理及AME-D潜在应用前景。过去人们认为AME-D是由一个微生物群落完成的，在这个群落中，反硝化细菌利用好氧甲烷氧化菌排出的碳中间体作为能量和碳源。潜在的碳中间体包括甲醇、柠檬酸和乙酸盐。 这篇简短的综述提出了微生物的热力学评估，并假设甲醇是理想的反硝化电子供体，并可作为甲烷菌和反硝化菌之间的营养联系。新的发现表明，AME-D不仅局限于甲烷菌和反硝化菌之间的传统协同作用。一种专性好氧产甲烷菌，即反硝化甲烷单胞菌FJG1，已经被证实在缺氧条件下，将部分反硝化作用与甲烷氧化反应结合，最终释放出一氧化二氮。这一发现不仅极大地促进了对AME-D机制的理解，也意味着好氧甲烷氧化菌通过对生态系统中甲烷和氮循环的影响，在全球气候变化中起着重要但未知的作用。因此，对微生物学和机制的进一步研究对于更好地理解全球气候问题和开发生态位生物技术解决方案至关重要。这篇简短的综述还介绍了传统的微生物技术，如纯培养和稳定的同位素探测，以及强大的微生物技术，如(元)基因组学和(元)转录组学，以解密甲烷氧化和反硝化作用的链接。虽然AME-D在废水、饮用水和地下水脱氮方面具有巨大的潜力，但其存在的瓶颈和潜在问题也被进一步讨论。 原名：Microbiology and potential applications of aerobic methane oxidation coupled to denitrification (AME-D) process: A review 期刊：Water Research IF：7.913 通讯作者：吴伟祥 作者单位：浙江大学 甲烷是一种臭名昭著的温室气体，直接或间接导致地球气候变暖。甲烷氧化-反硝化过程可以应用于氮污染控制，同时抵消富营养化和大气甲烷浓度。一般来说，根据所含氧的不同，甲烷氧化与反硝化联合作用可分为好氧甲烷氧化与反硝化作用(AME-D)和厌氧甲烷氧化与反硝化作用(ANME-D)。AME-D具有三大环境和生态意义： ① 首先，好氧甲烷氧化和反硝化分别是生物地球化学甲烷循环和氮循环的主要途径。 ② 其次，AME-D为两种重要的温室气体甲烷和一氧化二氮(N2O)的消耗和产生提供了重要的联系。 ③ 最后，AME-D提出了一种在饮用水，废水或垃圾填埋场渗滤液中去除硝酸盐（NO3）/亚硝酸盐（NO2）的潜在替代方法。 这篇小综述的目的是收集和分析文献，强调已知和未知的AME-D过程中微生物分类和生理功能，并概述AME-D过程中微生物的机制，利用热力学对其代谢过程中的不确定性区域进行评估和预测。在此基础上，进一步探讨了好氧甲烷氧化与反硝化相互作用的一些传统方法和潜在的先进微生物技术。最后，展望了AME-D在污水处理中的潜在应用前景和未来挑战。 1 AME-D 过程微生物 由于好氧甲烷氧化菌的栖息地不同，了解好氧甲烷氧化菌之间的生理差异是了解不同条件下甲烷氧化代谢途径的关键。在不同的环境下，好氧甲烷菌具有不同的生理特性和甲烷分解代谢能力，对氮氧化物(NOx)代谢的影响能力也不同。根据形态特征、膜结构、鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)含量、磷脂脂肪酸(PLFAs)等，将可培养的好氧甲烷菌分为三类(I型、II型和X型)。相关信息汇总在表 1 and 2。 通常情况下，c14和c16脂肪酸被认为是第I型好氧甲烷氧化菌的优势脂肪酸，而c18脂肪酸在第II型好氧甲烷氧化菌中显著。在过去的几十年里，先进分子生物学技术的发展取得了巨大的进步，而这些技术的后续应用彻底改变了我们对好氧甲烷微生物学的认识，并改善了它们的分类地位。好氧甲烷氧化菌分为三个不同的科:Methylococcaceae(14个属)、Methylocystaceae (2个属)和Beijerinckiaceae (3个属)。 好氧产甲烷菌在好氧条件下将甲烷氧化为CO2(图1)。该途径由甲烷单氧合酶(MMO)启动，生成甲醇作为中间体。随后，甲醇被吡咯并喹啉醌（PQQ)依赖的甲醇脱氢酶(MDH)氧化形成甲醛。一部分甲醛通过单磷酸核酮糖(RuMP)途径或丝氨酸途径被吸收，释放出乙酸和柠檬酸等有机中间体。甲醛的另一部分通过甲酸途径被异化形成CO2，而甲酸途径又为初始的甲烷氧化步骤提供了还原性的等烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADHs)。 一些来自甲基球菌属和甲基藻属的变形细菌产甲烷菌可以利用CO2作为碳源。MMO是一种由好氧甲烷氧化菌所包藏的独特的多组分酶，以两种不同的类型出现:细胞质溶胶- uble甲烷单加氧酶(sMMO)和膜结合微粒甲烷单加氧酶(pMMO)。pMMO广泛存在于目前已知的变形杆菌产甲烷菌中。pmoA的遗传序列与amoA(编码单氧合氨酶[AMO])具有相似性。此外，pMMO和AMO在还原剂、抑制剂和活性位点上也有一些共同的性质，导致甲烷和铵的氧化途径相似。 
表1 好氧甲烷菌的形态、结构和生理特性。
表2 好氧甲烷菌的系统发育特征。
图1 好氧产甲烷菌的甲烷代谢途径。
反硝化是氮循环的一个重要分支。反硝化细菌广泛分布于细菌、古生菌和真菌中。完整的反硝化作用是硝酸盐逐步还原为亚硝酸盐、一氧化氮、一氧化二氮和氮气的过程。整个反硝化过程的每个反应步骤都有相应的酶：硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶以及一氧化二氮还原酶 (NAR, NIR, NOR andN2OR)。然而，并不是所有的反硝化细菌都具有这四种类型的酶。因此，一些反硝化菌不能进行完整的反硝化作用。根据反硝化细菌所拥有的酶的种类，反硝化细菌可分为四类，即、完全反硝化微生物、亚硝酸盐还原菌、不完全反硝化菌、不完全亚硝酸盐还原菌(表3)。反硝化可以在厌氧和好氧条件下进行。在一些好氧甲烷营养体基因组中发现了nirS/nirK和norCB基因。虽然好氧反硝化的机制仍不清楚，但一些好氧甲烷氧化菌中甲烷氧化和部分反硝化双重功能的新发现对传统的AME-D过程的认识提出了挑战。
表3 四种类型反硝化微生物。
2.微生物在AME-D过程中的作用机制 为了了解AME-D作用机制，需要对每个反应步骤的功能微生物种群进行识别，并阐明其功能。由于微生物群落在生理和分类学上的复杂性，迄今为止，其机制仍不明确。目前，人们提出了两种解释。一种解释是好氧甲烷氧化菌的部分反硝化作用，最终产物是氮氧化合物，另一个是甲烷营养体氧化菌和脱氮反硝化菌形成协同代谢。到目前为止，虽然还没有已知的好氧甲烷营养体氧化菌表现出完全反硝化作用，但部分反硝化作用已被报道。最近发现表明，当在低氧条件下培养细菌时，反硝化基因(narG、nirK、norB和norC)的转录水平在Methylomonas denitrificansFJG1中显著升高。细菌的最终产物为乙醇。随着基因组测序和转录分析技术的迅速发展，揭示好氧甲烷菌部分反硝化潜能的基因组证据越来越多(表 4)。已有研究证实，好氧甲烷氧化菌中存在nirS、nirK、norB等参与脱氮阳离子过程的基因。有证据表明，好氧甲烷营养体能够在特定的高水平NOx的自然环境中生存，这是由于其氮素代谢的多样性。这也解释了为什么垃圾填埋场覆盖层和稻田土壤，这两个高氮负荷是含有多种甲烷菌的栖息地。
表4 好氧甲烷氧化菌基因组数据中涉及反硝化的基因。
2.2 NO3-/NO2-还原通过好氧甲烷氧化菌和反硝化菌在自然和人工环境中，我们推测AME-D是由好氧甲烷菌和反硝化菌共同作用完成的。好氧甲烷菌以甲烷为碳源和能源;反硝化菌能够利用好氧甲烷菌释放的可溶性有机中间体作为电子供体来还原NO3-/NO2- (图 2)。根据不同的中间体(单碳或多碳有机物)，反硝化细菌可分为两类:甲基营养性反硝化细菌和非甲基营养性反硝化细菌。可溶性有机中间体和主要功能微生物在不同体系之间存在显著差异(表S2)。甲醇、乙酸盐、柠檬酸，甚至多糖和蛋白质都可能是营养链的关键底物。柠檬酸盐是连接甲基单胞菌和非甲基化反硝化菌的关键代谢物。有机代谢产物(即。甲醇、柠檬酸、醋酸、甲醛和甲酸盐)潜在的甲烷菌释放的甲醛和甲酸盐可以作为脱氮的电子供体(表 5)。对于反硝化菌，在这些代谢物中，甲醇可能是理想的电子供体热力学。然而，对于好氧甲烷菌来说，从生理学上讲，甲醇不太可能被排泄到体培养基中：① 一方面，所产生的甲醇很容易被MDH捕获并迅速转化为甲醛。② 另一方面，甲醇是需氧菌形成甲烷氧化初始反应所需还原剂的关键底物。好氧甲烷菌释放的甲醇是好氧甲烷氧化和反硝化过程之间的关键中间体，这一事实不仅在大量的AME-D过程中得到了证明，而且在一个自然生态系统——华盛顿湖沉积物中也得到了证实。沉积物是研究好氧甲烷氧化的一个典型的自然栖息地。Methylobacter 和Methylotenera是主要微生物。可以认为，这些细菌可能参与了一个合作的行为，以实现AME-D。虽然这种协同作用的具体途径尚未被证实，甲醇可能是这种自然环境中好氧甲烷氧化和反硝化之间的重要联系。由于抗氧性的差异，在AME-D中涉及的反硝化菌分为两类:厌氧反硝化菌和好氧反硝化菌。目前，在由好氧甲烷菌和反硝化菌组成的菌群中，关于反硝化过程存在两种假说（图2）：② 另一种假设是反硝化器通过好氧反硝化菌进行反硝化P. stutzeri和Methylotenera mobilis出现在微有氧环境中。这两种假设可能同时出现在AME-D系统中，而且往往很难发现电子在耦合系统中是如何原位转换的。
表5 好氧甲烷菌释放的可溶性有机物可为为AME-D过程提供营养链接。
图2 好氧甲烷氧化途径与反硝化过程的营养链接。
3. AME-D过程热力学 底物中间营养链的识别(甲醇、柠檬酸盐、乙酸盐、甲酸盐等)，甲醇被认为是一个关键的底物。一方面，它是好氧甲烷营养体中甲烷代谢的第一个代谢物(图1)。另一方面，与其他中间体相比，氧化1mol甲醇可以释放更多的电子和能量(表5)。因此， AME-D可以分两个阶段完成: 1)好氧甲烷菌通过MMO将甲烷氧化为甲醇，并继续将一部分甲醇作为自身的能量和碳源进行代谢; 2)部分甲醇由产甲烷菌分泌到胞外环境中，被反硝化细菌利用，用于还原NO3-/NO2- (图 2)。 然而，当一个单位的甲烷被代谢时，分解到反硝化细菌和甲烷营养体本身使用的甲醇的百分比是模糊的，很难精确地推断出来。从热力学角度出发，使用由McCarty开发的Thermodynamic电子当量模型(TEEM)进行研究(1975)，以找出这个谜题。从理论上讲，可以用化学计量方程(Eqs)来描述包含在AME-D过程中的能量反应（公式1-3 表6）。所有的方程都是建立在一个电子当量的基础上。如前所述，甲烷营养体首先通过MMO将甲烷氧化为甲醇。这种氧化通常是需氧微生物在最初的氧化阶段将底物转化为能量生产的形式。假设1 mol甲烷被氧化成甲醇时，需至少X mol甲醇才能被好氧甲烷营养体后续氧化以支持其细胞过程，则剩余的甲醇部分可被反硝化剂作为电子供体加以利用。基于能量平衡的方程可以用公式(5)表示。 
ε表示的能量转移效率与价值0.37，为最低维持能量需求，约等于8.1 kJ / mol甲烷被氧化。根据这里提出的比例，总的反应AME-D(表6中的公式(4))可由Eqs导出。公式(1)和(3)表示极端情况，其中甲醇的最大数量(60%)是由好氧产甲烷菌向反硝化菌释放的能量。本文在标准条件的基础上进行了碳氮比的理论计算，可用于评价甲烷消耗通量与反硝化反应的最大比例。它可以帮助我们估计甲烷在AME-D系统中的利用效率。很明显，测定甲烷的消耗量更容易。在特定的操作条件下(SRT、温度、pH等)，理论上的C/N比率是可以校准的。
表6 好氧甲烷氧化和反硝化两阶段的化学计量方程。
4. 了解AME-D过程的当前和潜在技术 识别功能性群体和揭示甲烷和氮代谢途径是了解每个环境中AME-D过程的两个基本方向。在自然和人为生境中采用了各种技术来研究这一过程，每项研究的主要结果载于表S2 (SI)。纯培养一直被认为是一种传统的但不可或缺的方法，以了解AME-D的过程。在此基础上，成功地论证了AME-D过程的新途径和常用途径:分离了甲烷氧化型和不完全反硝化型好氧甲烷微生物(如M. denitrificans FJG1)。AME-D进行了好氧甲烷微生物(Methylomonas 和 M. capsulatus) and 反硝化菌(P. stutzeri 和Hyphomicrobium)的混合培养，其中柠檬酸和醋酸是可能的营养联系。然而，传统的微生物分离方法受到了限制，为准确鉴定微生物多样性带来了障碍。需要改进传统方法。① 一种方法是在实验室中模拟类似的好氧甲烷菌和相关脱氮菌的生存条件。荧光染料标记探针与流式细胞术(FCM)的结合。基因组学和元基因组学是强有力的、与pcr无关的工具，能够从遗传信息中提供潜在代谢途径的全面信息。与基因组学和元基因组学相比，转录组学和元转录组学以微生物的mRNA为目标，提供更能反映甲烷和氮化合物实际代谢的信息。虽然元组学技术，特别是针对样本中混合微生物的RNA和蛋白的转录组学和宏蛋白质组学仍处于发展的早期阶段，但将SIP技术与这些技术相结合，可以为今后研究AME-D过程的详细机制提供有力的工具。集成技术在单细胞水平SIP，如荧光原位杂交-二次离子质量光谱法(FISH-SIMS)和纳米scale-SIMS (Nano-SIMS)已成功地用于研究碳循环和镍循环的机理。预期这些技术可以用于理解主要由未培养的甲烷菌和反硝化菌组成的AME-D系统。无论是在自然环境、污水处理厂还是在人工生物反应器中，组合技术都能很好地帮助我们理解这一过程。
5. AME-D工艺在污水处理中的应用前景 硝化和反硝化是去除废水中无机氮的两个常规步骤。在传统的生物脱氮工艺中，由于碳不足，必须加入甲醇等简单有机物来支持脱氮。如果过多的补充碳源，不仅会增加额外的成本，还会造成污染。越来越多的证据表明，甲烷具有作为反硝化电子供体的潜力：① 一方面，由于甲烷可以通过污水处理设施中污泥和有机废物的厌氧降解而产生，因此甲烷价格低廉，且广泛存在。② 另一方面，与甲醇和乙酸相比，甲烷产生二次污染的可能性较小，尤其是在饮用水和地下水脱氮方面。因此，利用现场释放的甲烷进行反硝化可以既经济又环保。尽管在实验室规模下，AME-D表现出了良好的性能，但仍有一些固有的局限性需要评估和解决：① 首先，基于AME-D混合了甲烷和氧气两种可燃气体，构成了安全隐患。② 其次目前对AME-D的研究主要集中在反硝化性能上，而忽略了随之而来的氮氧化物排放。③ 第三，膜污染和通过污染膜输送气体的高能源成本对这一技术提出了重大挑战。最后，应该评估这项技术的经济方面。AME-D过程是连接甲烷和氮的生物地球化学循环的途径：2) 好氧甲烷菌和反硝化菌协同作用的不完全/完全反硝化(传统途径)。在后一种途径中，甲醇在热力学上被认为是甲烷菌和反硝化菌之间理想的营养联系，但在不同的生理条件下，甲醇的营养联系是不同的。新兴的先进技术，如元基因组方法、FISH-SIMS和Nano-SIMS，提供了强大的工具来揭示新颖的AME-D过程途径。在实际应用中AME-D过程在废水脱氮处理中具有巨大的应用潜力。然而，其工程应用的仍然存在问题。应充分重视AME-D工艺，开发经济可行的工程解决方案和先进的生物技术。本论文综述了AME-D过程中微生物分类和生理功能，并概述AME-D过程中微生物的机制，利用热力学对其代谢过程中的不确定性区域进行评估和预测。在此基础上，进一步探讨了好氧甲烷氧化与反硝化相互作用的一些传统方法和潜在的先进微生物技术。最后，展望了AME-D在污水处理中的潜在应用前景和未来挑战。本综述为理解AME-D过程提供了重要参考和见解。
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