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编译：Mushroom，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 抗生素耐药性是全球关注的公共卫生问题，家畜在耐药性的形成和传递等方面扮演着重要的角色。奶牛肠道内携带着抗生素耐药基因的微生物通常对临床上重要的抗生素具有抗性，微生物通过粪便排出体外后，会对环境产生更多污染。 1.通过对哺乳期犊牛粪便样品进行宏基因组测序，分析了初乳在犊牛肠道微生物富集、耐药性以及肠道菌群和日粮结构之间的关系。 2.哺乳犊牛肠道微生物携带329种抗生素耐药基因（ARGs），可能对17种抗生素产生耐药性，并且随着哺乳量的减少，ARGs的丰度逐渐下降。 3.实验发现，初乳是哺乳犊牛获得ARGs的潜在来源。 4.哺乳期犊牛肠道微生物ARGs丰度在哺乳期不同阶段呈现动态变化。 5.犊牛日粮结构与耐药基因的产生密切相关，可通过调整日粮结构改变肠道菌群多样性和丰度，减少抗生素耐药基因的产生，从而降低耐药性。 论文ID 原名：The fecal resistome of dairy cattle is associated with diet during nursing 译名：奶牛哺乳期日粮结构对其肠道微生物耐药性的影响 期刊：Nature Communications IF：11.878 发表时间：2019.9 通讯作者：David Andrew Mills 作者单位：加利福尼亚大学戴维斯分校健康食品研究所 实验设计 选取22头新生犊牛，出生12小时内，饲喂2次优质牛初乳，然后饲喂代乳粉和一种商业犊牛发酵剂，直到断奶。断奶期间（8-10周），停止饲喂犊牛发酵剂，将代乳粉减少到一次，并引入全价混合日粮（TMR），从出生到第10周，采集新鲜粪便（n=484）和牛初乳（n=44），提取样本DNA进行多样性分析、宏基因组分析及qPCR检测，并利用R软件进行统计分析。探究奶牛生命早期的肠道抗生素耐药基因的来源，揭示日粮结构的改变和饲养时间对哺乳犊牛肠道微生物耐药性的影响。 结果 1 新生犊牛肠道菌群的建立 犊牛出生后10周内肠道微生物群落呈现动态变化（图1）。α多样性随着时间的推移显著增加（图1b），超过60%的肠道微生物分别为瘤胃菌科、毛螺菌科和拟杆菌科（图1d）。检测发现犊牛出生后第1周，肠杆菌科细菌占粪便菌群的25％左右，在饲喂初乳和代乳粉后，该科的相对丰度显着下降至不足5％（图1d）。而初乳样本中，链球菌科，肠杆菌科和肠球菌科的细菌约占菌群的90％（补充图1c）。总之，随着年龄的增长和日粮结构的多样化，犊牛肠道微生物群落多样性也在增加。 以初乳中的微生物群落和各个时间点犊牛肠道微生物群落为对象，评估细菌传递可能性进行实验，实验结果表明，初乳是特定细菌物种的载体，这些细菌能够在犊牛肠道微生物群落中检测到，且能够短暂存在。 图1 犊牛出生10周内肠道微生物群落的动态变化 a. 犊牛的日粮、采样和测序方案（n=22），TMR表示全价混合日粮；b. 通过Chao1丰富度和Shannon多样性指数衡量的α多样性箱线图；c. 基于GUniFrac的乳类粪便样品的NMDS分析；d. 条形图描述了细菌群落随时间的相对丰度；相对丰度小于1％的未分类的分类单元和细菌家族被归类为“其他”。 2 犊牛肠道微生物携带ARGs丰度与时间相关 对3头犊牛的12份粪便样本进行ARGs检测，结果发现在第2天的样本中超过50％的ARGs具有多重耐药性表型，但是，这些ARGs的相对丰度随后有所下降。相反，随着时间的推移，四环素抗性逐渐增加，在第7周达到70%以上的相对丰度（图 2a）。此外，肠道微生物携带的抗生素耐药基因丰度随着时间的推移而显著变化(Bray-Curtis；PERMANOVA；P=0.002)，早期样本(第2天和第5天)差异较大，而后期样本（第3周和第7周）相似度较高，犊牛肠道微生物携带的耐药基因发生了显著变化（图2b）。 图2 不同时间点犊牛肠道微生物耐药性变化 a. 犊牛肠道微生物具有广泛的抗生素耐药谱，包括对17种抗生素的耐药性；b. 牛肠道微生物耐药性的二维NMDS分析，显示了PERMANOVA评估的耐药性随时间的变化 除了肠道微生物耐药性发生变化外，ARGs的总丰度也随时间显著下降，从第2天每16S rRNA基因5.14拷贝开始，下降至第7周每16S rRNA基因0.77拷贝(Friedman检验)；P=0.02)(图3a)。与预期一致，犊牛之间肠道微生物耐药性差异很小，其ARGs丰度随时间动态变化。与逐渐减少的总丰度不同的是，从第2天到第5天，犊牛中存在的ARGs种类（ARGs丰富度）显著增加，随后逐渐下降(Friedman检验)；P=0.04)（图 3b）。 通过对ARGs分析可知，检测到的ARGs属于75个不同的细菌科，肠杆菌科、Lachnospiraceae、肠球菌科、鲁米诺球菌科、杆菌科、链球菌科和梭菌科占ARGs总丰度的69.45%，占全部检出ARGs的96.66%(图 3c)。在这些微生物类群中，肠杆菌科的分布最多，属于这一科的细菌数量随着时间的推移逐渐减少(图3c)。肠杆菌科90%以上的微生物是大肠杆菌(补充图4)。与观察到的ARGs丰富度的总体动态相一致，所有细菌家族在第5天不同ARGs的数量最高，随后呈逐渐减少的趋势(图3d)。通过对取样期间肠杆菌科内ARGs的丰度检测发现，其丰度在第1周后下降（从第1周到第7周减少7.6倍；补充图 5c），但肠杆菌科细菌的绝对丰度在整个采样期间始终保持相对恒定。 图3 犊牛肠道微生物携带耐药基因数量随时间的变化 a. 第2天至第7周犊牛ARGs总丰度分布箱线图 b. 随着时间的推移,犊牛携带特异性ARGs数量的箱线图c. 犊牛ARGs细菌家族及相关抗性基因丰度的预测。其中前7个科占ARGs总丰度的69.45%，占ARGs多样性的96.66%，其余细菌类群归为“其他”类。每个时间点对应特定家族的ARGs(每拷贝16S rRNA基因)根据其大小和颜色进行分类。d. 预测各个细菌科的ARGs丰度随着时间的变化 重要的是，对MLS和四环素类药物具有抗药性的ARGs在第一周内增加，但在第5天一直保持较高水平，直到取样结束(Friedman检验;P < 0.05)（图 4）。特别是四环素耐药基因tet32，tet40，tetO，tetQ和tetW以及包括ermB，lnuC和mefA在内的MLS抗性基因，显示从第2天到第7周的丰度逐渐增加（补充图 6）。qPCR结果表明，从第2天到第7周，四环素抗性基因tetQ的绝对丰度增加了900倍（补充图7）。 图4 对MLS和四环素类药物的耐药性分布 “*”表示P<0.05；“n.s.”表示P>0.05；以黑体表示IQRs的中位图 ARGs的传递极大地促进了抗生素耐药性的全面传播，是一个特别令人关注的问题。为了评估这些基因在犊牛中的传播情况，在犊牛肠道微生物中共检测到67个具有传递能力的ARGs，这些ARGs可对10类抗生素产生抗药性（图 5）。ARGs广泛分布于23个细菌科，其中肠杆菌科、肠球菌科、消化链球菌科和链球菌科ARGs分布最多（图 5）。 图5 预测的67个可转移的ARGs细菌家族 ARGs按抗生素类别分组。细菌家族按照目前存在的ARGs多样性从上到下依次排序，其中携带ARGs多样性最多的家族居首位 3 早期ARGs 90%来源于初乳 为了证实初乳是犊牛肠道微生物ARGs重要的传递者，对初乳中的微生物群落进行分析，在初乳中检测到的105种ARGs中，在肠道微生物中存在73种，占犊牛肠道微生物检测到ARGs总数的约90.1％（73/81）（图 6a）。肠道微生物所携带的ARGs的总体含量要高于初乳，但初乳中微生物所携带的ARGs种类更多（图 6a，b）。实验结果显示，初乳-肠道粪便样品之间的微生物携带耐药基因的情况具有显著相关性（图 6c）。由此可见，初乳是传递ARGs的载体。 图6 ARGs从初乳到犊牛的垂直传播 a. 维恩图表示初乳和第2天的犊牛粪便样品之间共享的ARGs；b. 点表示初乳和第2天粪便样品中的ARGs群，点的大小表示丰度，线的颜色表示动物 c. 初乳和粪便样品中ARGs的相关性。C代表初乳样品，F代表粪便样品。每个犊牛收集了两个初乳样品和一个粪便样品进行此分析，并添加了数字以区分动物之间的样品 4 BMRGs与ARGs共存 在犊牛肠道微生物中共检测到104个MRGs（补充图9，补充数据2），对包括Sb、As、Cd、Cu和Ag在内的15种不同的抗菌金属化合物具有抗性（补充图10）。此外，研究还发现在奶牛样本中有34个基因可产生一种生物杀菌剂抗性表型（补充图11，补充数据2）。与犊牛肠道微生物携带的ARGs数量变化相似，我们观察到BRMGs丰度会随时间的延长而降低（Friedman检验；P <0.05），但不同抗性基因的数量没有显著变化（Friedman检验；P>0.05）（图 7b）。总之，随着肠杆菌科细菌相对减少，BMRGs与ARGs的丰度随时间而降低。 图7 生物杀菌剂和金属抗性的分布 a. BMRGs丰度箱线图，在抽样过程中，BMRGs显著下降 b.犊牛肠道微生物BMRGs丰富度的箱线图。“*”表示P<0.05，“n.s.”表示P>0.05 根据犊牛肠道微生物宏基因组测序结果预测，至少一半的ARGs和BMRGs具有转移能力，网络推理建模结果表明，犊牛肠道微生物携带的ARGs和BMRGs密切相关，且ARGs和BMRGs之间可能在肠道微生物中同时存在（图8）。 图8 犊牛肠道微生物中ARGs和BMRGs之间交互网络图 5 日粮结构改变对犊牛肠道微生物抗生素耐药性的影响 由于犊牛肠道微生物抗生素耐药性在日粮结构改变时发生了显著的变化，因此我们探讨日粮结构的变化与肠道微生物ARGs之间的关系。首先分析了在碳水化合物消化时的两个主要酶类，COG和CAZy。粪便基因组的COG和CAZy含量分析表明，粪便微生物群落的功能结构随时间推移发生了显著的变化（Bray-Curtis； PERMANOVA；两种情况均P <0.05），其中第1周差异最大（第2天与第5天相比）（图 9a，b）。具体来说就是CAZy酶家族（CAZy家族多样性）数目逐步增加（Friedman检验；P＝0.04）（图 9c）。犊牛肠道微生物组由6类注释CAZy的酶组成，超过70％的CAZy归属于糖苷水解酶或糖基转移酶（图 9d）。其中，从第3天开始，糖苷水解酶的相对丰度开始增加，而糖基转移酶的相对丰度降低，编码多糖裂解酶的基因直到第5天才能检测到，而其他与CAZy相关的酶（辅助活性）仅在第2天和第5天能检测到（图 9d）。 图9 随着时间的推移，犊牛肠道微生物群落的功能变化 a. 基于Bray-CurtisCOG通路的二维NMDS分析 b. 基于Bray-CurtisCAZy的NMDS分析 c. 从第2天到第7周,犊牛CAZy酶（家族）的丰富度 d. 随时间推移每类酶的CAZy家族相对丰度的条形图。“*”表示P<0.05，“n.s.”表示P> 0.05 DESeq2丰度差异性分析结果显示，犊牛肠道微生物中有71个CAZy家族随时间推移发生了显著变化，其中50％是糖苷水解酶（图 10a）。每个显著变化的CAZy家族在科水平上丰度分布如图10b所示 。总而言之，CAZy酶丰度的变化表明，随着时间的推移，ARGs的减少不仅是由于没有初乳，而且还因为日粮中存在新的碳源，这些碳源驱动大量的分类单元，这些分类单元包含可以消化植物多糖的酶。巧合的是，总体ARG也很低。 大多数CAZy酶在早期表现出较高的丰度，在后期(CE8-GH108和GH127-GT51)下降(10b)。其中，含乳糖酶家族GH1(EC 3.2.1.108)在第2天的丰度最高，这和当时以牛奶为主的日粮结构有关。相反，CAZy酶(GH20-GH 30和CE6-GH27)在后期表现出较高的丰度，这可能与杆菌科有关(图10b)。GH 97家族(包括糖苷酶(EC 3.2.1.3)和α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20))和GH 57家族(包括α-淀粉酶家族(EC 3.2.1.1))随着时间的推移显著增加，可能是由于淀粉作为主要碳水化合物来源的犊牛添加剂摄入量增加所致(1A)。CAZy酶丰度的变化表明，随着时间的推移，ARGs的减少并不是由于停止饲喂初乳，而是因在日粮中添加了新的碳源，这些碳源能消化植物多糖，与此同时，发现这些酶还能将总体ARGs调控到较低的水平。
图10 粪便CAZy家族的丰度、分布和预测细菌分类 a. 描述CAZy酶随时间推移的聚类分布热图，仅包括差异丰富的酶(n=70) b. 高丰度的细菌家族产生相应的酶情况。圆点表示肠杆菌科（蓝色），拟杆菌科（粉红色）和其他（橙色）。没有小圆点表示在特定时间点的特定犊牛中，未检测到我们无法预测细菌来源或CAZy家族。GH1包括乳糖酶(EC 3.2.1.108)，GH 97包括糖苷酶(EC 3.2.1.3)和α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)，GH57家族包括α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。CBM0、CE0和GT0分别指CAZY数据库下载07152016中未分类的CBMs、CEs和GTs。与DESeq 2的差异度分析表明，随着时间的推移，71个CAZy家族发生了显著的变化，但有一个CAZy家族GT 80未能检索到细菌来源，因此这里总共显示了70个CAZy家族。 结论 哺乳犊牛肠道微生物携带329种抗生素耐药基因（ARGs），可能对17种抗生素产生耐药性，初乳是哺乳犊牛获得ARGs的主要来源。犊牛日粮结构和时间(年龄)对奶牛肠道微生物区系的分类构成具有显著影响，同时会影响肠道微生物的抗生素耐药性，可通过调整日粮结构改变肠道菌群多样性和丰度，减少抗生素耐药基因的产生，从而降低耐药性。 评论 抗生素耐药性是一种全球性的公共健康威胁，随着抗生素药物在临床上的广泛使用，耐药性和多重耐药性的问题日趋严重，近年来研究发现，抗生物耐药性的形成与其药物耐药基因(ARGs)传递密切相关，因此研究新的方法来控制携带和传播ARGs的细菌群是解决这一问题的关键所在。与人类相比，抗生素在家畜中的使用要多得多，家畜中普遍存在的耐药性限制了治疗时抗生素的有效选择，并可通过食物链或环境污水传递给人类，造成严重后果，长期下去，可能会进入到令人惶恐的“后抗生素时代”。鉴于以上情况，了解哺乳犊牛肠道微生物中耐药基因的来源、分布和变化，对减少和控制耐药基因传递，具有重要意义。本研究表明，奶牛哺乳期的肠道微生物抗生素耐药基因主要来自牛初乳中的微生物，并受到饲喂时间和日粮结构的影响，据此，或可通过日粮干预改变肠道微生物菌群结构，减少耐药基因的传递，降低耐药性。
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