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编译：木子，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 Ⅰ型糖尿病（T1DM），又名胰岛素依赖型糖尿病，在体内胰岛素绝对缺乏的情况下，会引起血糖水平持续升高，出现糖尿病，进而会导致一系列并发症甚至死亡。随着Ⅰ型糖尿病（T1DM）患者的逐年增加，糖尿病已成为一种全球最重要的公共卫生问题。近年来肠道菌群与T1DM的发生和发展密切相关。本研究通过腹腔注射75mg/ kg链脲佐菌素来构建SD大鼠T1DM模型，收集粪便样本并提取DNA，构建16S rRNA微生物基因克隆文库，最后进行高通量测序和生物信息学分析。 结果表明，T1DM大鼠中，与感染和炎症相关的一些致病菌的含量上调，如Ruminococcaceae, Shigella, Enterococcus,Streptococcus, Rothia, Alistipes等，而一些有益菌的含量减少，如Lactobacillus, Faecalitalea, Butyricicoccus 和 Allobaculum等。其中，Butyricicoccus 和Allobaculum能通过产生短链脂肪酸来保护肠屏障功能。这项研究表明，肠道菌群失衡引起的肠道炎症和短链脂肪酸（SCFA）的减少对于T1DM的发病机理至关重要。 论文ID 原名：Investigation of gut microbiome changes in type1 diabetic mellitus rats based on high-throughput 译名：Ⅰ型糖尿病大鼠肠道微生物组变化研究 期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy IF：3.743 发表时间：2020年01月 通讯作者：王停、赵保胜 作者单位：北京中医药大学科研实验中心 实验设计 结果 1. 一般指标 如表1所示，与对照组相比，T1DM大鼠的空腹血糖显著增加（p <0.01），体重显着下降（p <0.01），食物和水的摄入量同时显著增加，表明T1DM组大鼠出现典型的糖尿病症状。 2. 胰腺的组织病理学检查 如图1所示，对照组大鼠胰腺组织病理学检查显示，外分泌腺泡和内分泌细胞形态正常，胰岛细胞排列不规则，数量和形态均正常，未见异常病理改变。而在T1DM大鼠的胰腺病理学检查中，胰岛数目减少，剩余的胰岛中胰岛实质细胞显示出轻度或中度增生，与对照组相比，T1DM大鼠的胰岛损伤严重，胰岛数目减少，胰岛细胞明显增生，提示T1DM大鼠胰岛损伤与T1DM的典型病理变化是一致的。 3. 肠道菌群分析 Simpson和Shannon指数用来反映样本中菌群的多样性，Chao和ACE指数用来反映菌群的丰富度，Coverage指数用来反映样本的检测深度。如表2所示，两组样品的覆盖指数均大于99.9％，表明检测到样品中所有肠道菌群的序列。 Alpha多样性分析结果表明，与对照组相比，T1DM大鼠肠道菌群多样性明显增加，丰富度增加，这与肠道菌群多样性增加与疾病相关的报道一致。 采用主成分分析法（PCA），我们对对照组和T1DM组肠道微生物组的差异进行分析，结果如图2A所示，两组之间的差异显著，表明成功建立了T1DM模型。样品的和弦图，热图和分层聚类分析结果直接表明，两组之间的肠道微生物组组成不同（图2B，2C，2D）。这些结果初步表明，对照组和T1DM大鼠之间肠道微生物组的组成存在显著差异。 为了进一步探讨两组之间肠道菌群结构的差异，我们分析了它们的门类和纲水平特征。除了菌群丰度低（<1％）外，我们发现两组大鼠的肠道菌群基本相同，但不同菌群的菌落存在差异，这使得优势菌和菌群的整体结构成为可能。两组之间的微生物群显著不同，这可能是两组大鼠表型不同的重要原因。 具体而言，在门水平上，对照组和T1DM组大鼠的优势门系是Firmicutes 和 Bacteroidetes，在对照组中，其丰度分别为58.5％和38％，在T1DM组中，分别为61.3％和32.6％，对照组与T1DM组之间差异较小。值得注意的是，如图3A所示，两组之间Actinobacteria的丰度差异很大，在对照组中，放线菌的丰度为0.323％，在T1DM大鼠中为2.2％。 在纲水平上，发现两组之间存在明显差异，并且丰度发生了很大变化。 Bacilli（45.1％）是对照组大鼠中的第一优势纲类，其次是Bacteroidia（38％）和Clostridia（12.6％），而在T1DM大鼠中，Bacteroidia（32.6％），Clostridia（30.0％）和Bacilli（26.2％）为含量最高纲类。在T1DM大鼠中，Clostridia显著上调，而Bacilli显著下调。另外，如图3B所示，T1DM大鼠中，Erysipelotrichia从0.8.5％显著增加至5.09％。 从科水平来看，大多数变化显著的细菌都集中在Erysipelotrichaceae, Ruminococcaceae,Lactobacillaceae 和Pretellaceae。 LEfSe多级物种层次树直接反映了在门-科水平上两组之间肠道菌群的差异（图4）。
为了进一步阐明两组之间的菌群差异，并获得可能与T1DM的发展密切相关的菌属，我们对两组样本的菌群从属水平进行详细分析。我们获得了34个菌属存在显著性差异（p <0.05）（表3），其中13个在T1DM大鼠中呈现上调，而21个呈现下调。 LDA分析的结果表明，34个不同细菌属的LDA值均大于2（LDA> 2.0，p <0.05）（图5），表明其组间存在显著差异。
值得注意的是，在34个细菌属中，有3个是高丰度细菌，在正常和T1DM大鼠中，包括g_Lactobacillus, g_[Eubacterium]_coprostanoligenes_group 和g_Ruminococceae_UCG-014。前者在T1DM大鼠中明显减少，而后两者明显增加，它们可能在T1DM的发展中起重要作用。此外，应注意，g_norank_c_Cyanobacteria, g_norank_o_NB1_n是T1DM大鼠的唯一属，而g_Candidatus Arthromitus，g_Parvibacter和g_norank_f_Flavobacteriaceae是对照大鼠中唯一的属，它们有可能被进一步研究作为诊断糖尿病的潜在指标。 T1DM。 4 肠道菌群、血糖和体重之间的相关性分析 为了进一步探讨细菌属与T1DM之间的密切关系，我们分析了肠道菌群，体重和血糖之间的相关性。结果表明存在很强的相关性，我们获得了与体重和血糖显著相关的细菌属（p <0.05）（表4，图6）。结果表明，g_Lactobacillus与血糖呈负相关，而g_Ruminococcaceae_UCG-014与血糖呈正相关，这与T1DM大鼠体内的丰度变化一致。 g_Ruminococcaceae_UCG-014，g_norank_f_Erysipelotrichaceae，g_ Bifidobacterium,g__unclassified_f__Lachnospiraceae和g_norank_f_Lachnospiraceae与体重显着相关，前三者与体重呈负相关，在T1DM大鼠中呈上升趋势，而另两个与体重呈正相关，在T1DM大鼠中呈下降趋势，这与T1DM大鼠消瘦的特征相吻合。g_Lactobacillus andg_Ruminococcaceae_UCG-014具有显著差异，并且对两组之间的差异具有更大的贡献。
5. 功能预测分析 16S的功能预测是通过PICRUSt软件标准化操作分类单位（OTU）丰度表，从而消除16S标记基因对物种基因组拷贝数的影响；然后通过Greengene ID获取每个OTU的KEGG Ortholog（KO）信息；根据KEGG数据库可计算出KO的丰度，可以得到KO，Pathway，EC信息，并且每个功能的丰度可以根据OTU的丰度来计算类别。如图7所示，碳水化合物代谢，氨基酸代谢，能量代谢，核苷酸代谢，脂质代谢和其他代谢途径是两组大鼠的主要途径。结果表明，T1DM大鼠的肠道菌群参与了更多的代谢过程，更多的代谢途径也在T1DM大鼠体内被激活，这与T1DM的代谢疾病相一致。
讨论 这项研究中，我们采用腹膜内注射链脲佐菌素的经典方法来构建T1DM大鼠模型。血糖，体重等一般指标的变化以及胰腺组织病理学检查都表明该模型已成功构建。在此基础上，我们重点研究了T1DM大鼠肠道菌群的变化，以找出与T1DM密切相关的菌群，为研究调节肠道菌群的降血糖新药提供实验依据和参考。尽管相关研究很多，但突破性研究很少，可重复性差，与T1DM发病密切相关的细菌属还需完全确认。在此基础上，需要进行大量的基础研究和反复验证，通过研究和分析，我们得出了一些重要的新结论，可为后续研究奠定基础。 就肠道菌群的总体结构而言，T1DM大鼠的肠道菌群的多样性和丰富性显著增加（p <0.05）。许多研究表明，肠道菌群多样性的增加与疾病密切相关。在这项研究中，在对照和T1DM大鼠中，Firmicutes和Bacteroidetes均为优势菌。它们与肥胖和糖尿病密切相关。一些学者将Firmicutes定义为“脂肪细菌”，将Bacteroidetes定义为“ 健康细菌”。随着Firmicutes/Bacteroidetes比例的增加，炎症反应和体重指数也增加，并且产生胰岛素耐受，最终导致糖尿病的发生。在本研究中，与对照组大鼠相比，T1DM大鼠肠道中的Firmicutes/Bacteroidetes的比例显著增加，表明T1DM的发生可能与Firmicutes/Bacteroidetes的比例变化有关。 除上述三个属外，T1MD大鼠中一些低丰度病原菌也明显上调。它们主要与感染和炎症有关，例如化脓性球菌的另一种常见细菌Streptococcus，属于条件致病细菌，可能引起化脓性炎症，毒素疾病和过敏性疾病等。Rothia是一种新发现的条件病原体，近年来不断有报告称其能引起感染。Alistipes被认为与结肠炎有关。此外，本研究中，产生乳酸的细菌也被上调，例如Faecalibaculum增加了10倍。 Faecalibaculum最初被发现在小鼠的粪便中产生乳酸，肠道中高水平的乳酸可能导致高乳酸血症和糖尿病乳酸性酸中毒。在下降的菌群中，T1DM大鼠组中应注意Lactobacillus, Faecalitalea 和 Alobaculum。Lactobacillus是典型的有益细菌，发现表达ACE2的Lactobacillus对糖尿病小鼠具有治疗作用，而Lactobacillus发酵剂可提高人的抗氧化能力并预防妊娠高血糖。其他研究也发现，植物Lactobacillus发酵可以改善人体免疫系统的功能，抗高血糖症，并增强肠道蠕动的生理活性。在本研究中，Lactobacillus是两组中最丰富的细菌，对照组的丰度为40.17％，T1DM组的丰度为22.63％。Lactobacillus与血糖之间存在显着的负相关性，表明Lactobacillus可能在调节血糖方面发挥重要作用，其含量降低可能与糖尿病的发生有关。Faecalitalea属于厚壁菌门，能发酵D -葡萄糖、蔗糖、D -甘露糖和棉子糖，代谢的主要最终产物是丁酸，丁酸能促进餐后胰岛素分泌，改善糖尿病患者的胰岛素反应。本研究中，T1DM大鼠肠道中Faecalitalea含量下降200多倍，提示其可能在糖尿病发病机制中发挥重要作用，可能与胰岛素分泌减少有关。Allobaculum被认为是小鼠的肠道内的有益细菌，能抑制小鼠体重增加，发现服用低剂量抗生素的小鼠在四周体重明显增加,其中一个重要原因是，低剂量的青霉素抑制Allobaculum；也有研究表明，Allobaculum是肠内产生SCFAs的有益菌，可以直接或间接地起到抗炎作用，保护肠屏障功能，通过增加肠内SCFAs的含量来调节人体的新陈代谢和免疫。尤其能预防和治疗肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病等代谢性疾病。本研究中，Allobaculum在T1DM大鼠肠道中的含量减少了60多倍，提示其可能参与了糖尿病的发病过程，且T1DM组中Adlercreutzia和Butyricicoccus的减少也显著，丰度变化超过10倍。Adlercreutzia被认为是一种有益肠道健康的细菌，具有一定的免疫调节作用。Butyricicoccus对微生物生产SCFAs具有重要意义，增加了肠道中SCFAs的浓度，降低肠道中pH值，抑制了有害微生物的生长，改善了肠道菌群的结构和代谢能力。Dorea是人体肠道内主要的产气菌，它可以通过碳水化合物产生气体，被认为是一种有益菌。T1DM大鼠Dorea含量的降低可能与疾病的严重程度有关。Candidatus Arthromitus 是对照组中唯一的细菌，也与免疫调节有关，在肠道先天免疫功能和获得性免疫系统的形成中起关键作用。Candidatus Arthromitus的减少可能导致肠道免疫系统的失衡和一系列炎症反应。然而，T1DM组未检测到Candidatus Arthromitus，提示其消失可能与T1DM的发病有关。与SCFAs产生相关的细菌也有下调。Anaerofustis属于厚壁菌门，可发酵碳水化合物和生产乙酸和丁酸，其含量的减少可能导致乙酸和丁酸合成的减少，这可能引起肠道炎症反应的增加，从而导致脂质和糖代谢异常，进而导致T1DM的发生。 此外，主要值得注意的是，我们在T1DM大鼠的肠道也发现了一些异常状况，有益菌的增加，如Alloprevotella, Bifidobacterium,Anaerostipes，有害细菌的减少，如Helicobacter，这表明T1DM老鼠可能有自律效应来抵制胰岛损伤、胰岛素分泌不足和STZ所致的其他病理变化。其中，Alloprevotella是能够产生SCFAs的物种，其丰度与代谢综合征呈负相关；研究表明，Allobaculum可改善代谢综合征，预防硫酸右旋糖酐引起的炎症反应；Bifidobacterium是人肠道正常菌群中的重要益生菌，具有较强的免疫调节作用，口服双歧杆菌可通过改善高脂饮食小鼠的炎症反应，改善胰岛素抵抗，降低血糖；研究表明，大多数双歧杆菌能增强肠道内源性胰岛素刺激分泌肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的降血糖活性，从而抑制食欲，减轻体重，改善葡萄糖代谢。Anaerostipes是最重要的产丁酸细菌,丁酸是结肠上皮细胞首选的能量来源，其在维持人类结肠健康中扮演着重要的角色，补充丁酸的高脂肪饮食可以预防胰岛素抵抗和肥胖的发展, 产丁酸细菌往往对T2DM病人有益。T1DM组大鼠肠道有益菌水平升高，提示T1DM组大鼠可能通过自我调节抵抗STZ引起的胰岛损伤和胰岛素分泌不足。幽门螺杆菌是一种主要的人畜共患病病原体，幽门螺杆菌是一种主要的人畜共患病病原体，可引起人和动物的胃肠炎、肝炎等传染病，Helicobacter hepatica可引起免疫缺陷小鼠的炎症性肠病。Helicobacter Bilis的自然感染与多种肠炎疾病有关，通过胃管接种CB-17scid/scid后可观察到增殖性盲肠炎、盲肠黏膜增生、远端结肠慢性炎症。T1DM组大鼠肠道有害细菌的减少，提示TIDM大鼠可能具有自我调节作用。 结论 本研究表明，T1DM大鼠肠道菌群发生了显著变化。T1DM大鼠感染炎症相关病原菌丰度上调，如瘤Ruminococcaceae, Shigella, Enterococcus,Streptococcus, Rothia 和Alistipes，而有益菌和产SCFAs的细菌丰度降低，如Lactobacillus, Faecalitalea, Butyricicoccus和 Allobaculum等。这些结果表明，菌群失调与T1DM的发生显著相关，肠道炎症和SCFAs产生的减少导致的肠道菌群失衡可能在T1DM的发病机制中发挥重要作用。
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