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编译：莫沉，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 人体肠道微生物中含有大量的具有不同生化能力的细菌。现有的文献已经报导了许多药物可以被肠道微生物中的单个菌株代谢。然而，目前在整个微生物群落的背景下进行的相关研究还比较缺乏。 在本研究中，研究者首次开发了一个定量的实验方法来检测人体肠道微生物代谢小分子药物的能力，即微生物衍生的代谢(Microbiome-DerivedMetabolism, MDM)筛选。该系统包括用于特定受试者肠道微生物群落持续生长的分批次培养系统、体外药物代谢筛选平台，以及用于识别负责特定生理代谢过程的微生物编码基因的定向和非定向功能宏基因组筛选。该系统可以用于评估我们肠道中的微生物群落如何以化学方式转化或代谢口服药物，从而影响其安全性和有效性，提供了肠道细菌如何代谢体内药物的更完整的图谱，并可能有助于开发更有效、副作用更少、个性化的药物。 论文ID 原名：Personalized Mapping of Drug Metabolism by the Human Gut Microbiome 译名：人体肠道微生物组对的药物代谢 期刊：Cell IF：36.216 发表时间：2020.06 通讯作者：Mohamed S Donia 作者单位：普林斯顿大学分子生物学系 实验设计 本研究中，该团队首先聚焦于单个供体的微生物群落，从单个供体新鲜收集的和甘油储备的人体粪便样本在14种不同的培养基中进行培养，连续四天取样，并从中提取DNA，扩增细菌16S rRNA基因扩增，确定了能够支持其组成与原始单个供体微生物群最相似的菌群生长的培养基（modifiedGifu Anaerobic Medium，mGAM)）以及培养周期。接下来，通过化学提取，用高效液相色谱-质谱联用进行分析，研究者总共检测了575种口服药物，共鉴定出57种为微生物代谢相关，这些药物基于化学结构的不同可以划分为28种类别。该过程发现了以前从未报道过的微生物衍生代谢物，以及在人体内被报道过的与副作用有关但其来源未知的代谢物。接下来，研究者将上述方法扩展到多个个体，并验证了该筛选系统的稳定性和普适性。此外，研究者还追踪化学转化的来源以及特定的细菌种类和这些细菌中的特定基因，并在小鼠模型中体内验证了以上述方式发现的微生物衍生的代谢反应。 文章内容 目前，研究人体肠道微生物代谢口服药物的能力所面临的一个主要挑战是所涉及的细菌种类和菌株的多样性。由于系统地筛选数成千上万的分离菌株对抗数百种药物是不切实际的，之前的研究主要依赖于选定的一组代表性菌种的单一培养物。然而，在单一培养和混合群落中生长的菌株之间，基因表达和生化转化过程有很大的不同。为了解决这些挑战，研究者试图开发一种优化的体外混合培养系统，该系统支持给定微生物组样本中很大一部分物种的生长，并适用于高通量的生化筛选。 该研究的筛选工作，首先重点放在单个供体的微生物群落(pilot donor, PD)上。为了确定能够支持其组成与原始单个供体微生物群最相似的培养物生长的培养基和培养周期，从单个供体新鲜收集的和甘油储备的人体粪便样本在14种不同的培养基中进行培养，每天取样共计4天。然后研究者从所有样本中提取DNA，扩增细菌16S rRNA基因的V4区域，并对扩增产物进行深度测序(图1A)。根据测序结果推断出扩增子序列变异(amplicon sequence variants, ASV)，并确定了每个样品在不同分类水平上的组成。然后，研究者量化了不同培养基与单个供体在科水平上的差异(使用Jensen-Shannon divergence, DJS)，以及在单一ASV水平上单个供体的变异恢复情况 正如预期的那样，在不同的培养基和培养时间，其分类学组成和多样性都有很大的差异。一些培养基导致了高度多样化的群落结构，部分重现了原始粪便微生物多样性的一部分，而另一些培养基则几乎完全由一类菌落主导。在肠道微生物培养工作中常用的14种培养基中，研究者确定了一种名为modified GifuAnaerobic Medium (mGAM)，可以支持一个在组成和多样性上与单个供体最相似的细菌群落的生长(图1B)。在科水平上，mGAM培养基本上与单个供体的组成相匹配，主要不同之处在于通常观察到的兼性厌氧菌肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的扩张，而消耗专性厌氧菌瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)为代价。同时，在所有测试的培养基中，mGAM培养基的DJS与单个供体的差异最小，并且随着生长的进行，DJS与原始样本越来越相似。 即使在单一ASV水平上，mGAM培养基也可以捕获单个供体中的大部分多样性(mGAM培养基在所有培养基中具有最高的Shannon多样性，并且最接近单个供体) (图1C)。在单个供体中，有33个ASV的相对丰度在1%以上，其中26个(79%)出现在mGAM培养基的第二天培养中。总体而言，单个供体和mGAM之间第二天共享的ASV总量占单个供体成分的70%(按相对丰度计算)，这表明mGAM培养基可以囊括原始菌落结构的大部分。综上所述，mGAM培养基可以支持多种肠道微生物在单一培养中的生长，该研究结果支持将mGAM培养基第二天的培养用作单个供体微生物群的一种可行的体外批量培养系统。 2 微生物来源的代谢筛查用于识别已知的和新的药物与微生物之间的相互作用 有了针对供体的优化的体外培养系统，研究者接下来开发了一种结合生化和分析化学的方法来对供体衍生的微生物群落对临床上使用的口服药物的代谢能力进行筛查(图2)。每种药物制备3个样品： (1) 供体菌与药物(终浓度33 mM，符合胃肠道药物浓度)在mGAM中体外孵育24h， (2)与对照(DMSO)孵育的相似培养物； (3)在同等体积的无菌mGAM中与相同药物浓度孵育。 培养物和对照在37℃厌氧环境中再孵育24h，通过化学提取，用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)进行分析。研究者总共检测了575种口服药物，虽然这其中的大多数药物目前正在临床上使用，但只有不到10%的药物曾进行过微生物代谢相关的研究。 在575种药物中，研究者成功分析了438种(76%)；其余137种未通过微生物代谢相关筛选，其主要原因是药物稳定性问题或与所采用的提取或层析方法不相容。在可以进行分析的药物中，研究者共鉴定出57种(13%)为微生物代谢相关。这些药物基于它们的化学结构可以划分为28个药理类别，甚至更多 (图2B)。如前所述，该筛选条件确认了几个以前报导过的微生物代谢相关的几类药物，包括肌肉松弛剂丹特罗烯的氮还原、抗癫痫药氯硝西泮和降高血压药物尼卡地平的硝化还原；抗精神病药物利培酮中异恶唑部分的水解以及抗炎前药磺胺沙拉嗪的偶氮化。 更重要的是，该研究还确定了一组新的微生物代谢相关药物(45例，占总共发现的微生物代谢相关药物的80%)：10例是由于原始药物完全耗尽(或完全转化为逃避检测的代谢物)，35例是由于出现新的代谢物(图2C和2D)。在大多数情况下，新的代谢物表现出与其原始药物略有不同的高分辨率质谱(HRMS)或类似的HRMS/MS模式，表明上述物质是其衍生代谢物。为了明确代谢物的结构，研究者从共体菌培养的放大培养中分离将其分离，并使用核磁共振(NMR)与标准品进行比较来阐明它们的结构。对于氢化可的松，研究者确定微生物代谢导致C20上酮基的还原，产生20b-二氢可的松。对于醋酸氢化可的松，发生相同的修饰，但伴随着C21羟基的脱乙酰基。对于卡培他滨，研究发现微生物代谢导致完全去糖基化；对于米索前列醇和霉酚酸酯，研究发现酯水解转化；对于螺内酯，研究发现硫酯水解转化。这些药物的微生物代谢转化之前都没有报道过。最后，对于托卡朋，研究发现两个连续的转变，一个典型的硝基还原，然后是一个相对不常见的N-乙酰化-这两个转变以前都没有与这种药物的微生物联系起来(图2D)。 综上所述，这些结果确定微生物代谢筛查是一种可行的方法，用于通过肠道微生物组识别结构和药理不同的药物的已知的和新的生化修饰反应。有趣的是，根据已知的人体药代动力学研究，这些新发现的微生物代谢药物中的一些可能会对所涉及的药物的激活或毒性产生直接影响。该筛选方法的建立为上述问题提供了一个可能的解释，并首次解释了肠道微生物和托卡朋毒性之间的潜在联系。然而，上述发现都需要进行进一步的实验验证，以区分人体内和微生物来源的新陈代谢反应对筛选到的药物在人体内的药代动力学和毒性反应的影响。 3 将微生物来源的代谢筛查扩展到多个个体 研究者从20名健康供体(D1-20)收集了额外的新鲜粪便样本，并以与单个供体样本相同的方式进行处理。然后，在9种有代表性的培养基中培养每个样品，并使用16S rRNA基因测序来确定培养群落的组成(图3A-3C)。为了测量群落生物量，每种培养物一毫升被制粒和称重(STAR法；表S2C和S2D)。我们观察到培养特性有很大的差异，丰富度从20-135个ASV和平均水平不等。为了测量群落生物量，研究者将1mL的每种培养物制成球粒并称重，同时发现不同样本在培养特性上有很大的差异，丰富度在20-135ASVs之间，平均生物量密度在2-27.9g/L之间(图3D)。接下来，研究者想知道是否每个受试者的体外培养菌落都是真正个性化的，这是要使用体外培养菌落来评估微生物来源的代谢反应中的个体间差异性的一个重要的前提条件。在ASV水平上可以清楚地观察到不同培养之间的个体差异，并且具有明确的特定模式，这是个体捐赠者和其培养所特有的(图3C)。研究者发现，与非自身相比，供体粪便和自身体外培养的ASVs明显更多(47.1 vs 27.5, p <0.001)，这部分再现了供体粪便样本之间固有的个性化特征(图3E和3F)。此外，我们在20个捐赠者的粪便样本中鉴定出167个ASV是唯一的(每个捐赠者平均8.4个ASV)，并且在他们的体外试验中，这些ASV与同一供体的ASV一致。 接下来，研究者为了选择平均最适合在20个供体筛选实验室中使用的单一培养基，他们计算了一系列反应速率范围内所有培养基的预期可检测菌株数(图3G)。结果发现，BG培养基是在所估计的最具生理相关性的反应速率下的一种最佳培养基。此外，BG培养基还重现了原始粪便样本中很大一部分微生物群落结构。平均而言，BG培养基对原始粪便样本中高于1%的ASV的回收率为76.6%，对原始样本中高于1%的种、属和科水平的ASV回收率分别为84.7%、88.3%和92.7%(图3H)。从各成分的回收率来看，BG在ASV、种、属和科水平上的回收率分别为43.3%、57.3%、60.6%和62.8%。因此，研究者选择BG培养基作为20名供体筛选的培养基。下一步，研究者试图开发一种高通量的定量代谢组学方法来评估微生物来源的代谢与药物子集的个体间变异性。对最初的药物代谢筛查进行了几项改进。所有的实验步骤，包括孵育、化学提取和HPLC-HRMS分析，都是在96孔板上进行的，而不是在单独的试管中，体积从3mL降低到400 mL。该方法降低了每次培养的药物使用量，使该研究能够同时进行三个平行反应，并简化了化学提取和分析流程。此外，研究者还在化学提取过程前添加了已知浓度的内标，能够准确地量化部分药物消耗，以及完全药物消耗。 4 利用个性化微生物群落评估微生物衍生代谢物间变异性的定量代谢组学方法 对于所有20名供体，体外培养(BG培养基) 在96孔微孔板中平行三个进行孵育，23种药物中的终浓度为33 mM (图4A)。此外，研究者以同样的方法制备了非生物介质96孔板和热灭活微生物96孔板，在孵育24小时后，使用HPLC-HRMS分析经过化学提取的培养板和对照板。接下来，研究者设计开发了一种有针对性的代谢组学策略来量化微生物来源的代谢反应，通过计算药物残留率和代谢物水平，以评估在菌群存在的情况下药物的消耗和代谢物的产生。这两个指标都是使用曲线下面积(areaunder the curve, AUC)积分并归一化到内部标准来计算的。在供体菌-药物条件和供体菌-DMSO、中间药物和热灭活菌-药物的不同处理之间使用单边Welch’s t检验来确定代谢物产生的统计学意义，并使用BenjaminiHochberg方法对多个结果的p值进行校正。对于药物消耗，研究者使用相同的方法，并以供体药物和热灭活药物条件作为对照 (图4B和4C)。此外，研究者还进行了非靶向代谢组学分析，通过从所有样本中确定独特的分子特征，使用与靶向代谢组学类似的方法来确定统计学意义，并基于其HRMS/MS碎片模式验证代谢物与药物之间的关系，从而发现新的代谢物。然后使用上述相同的靶向代谢组学方法对来自非靶向代谢组学方法的所有验证代谢物进行量化分析(图4C)。 研究者观察到在供体间微生物来源的代谢持续阴性（酮康唑、吡喹酮、罗匹尼罗和托拉塞米），以及药物消耗(米索前列醇、尼卡地平和螺内酯)、代谢物产生(托卡彭和伏立诺他)或两者同时出现(氯硝西泮、利培酮和柳氮磺胺吡嗪)的微生物来源的代谢持续阳性，以及可变的微生物来源的代谢反应(图4B-4D)。这种变异性发生在药物消耗(酮洛芬和左炔诺孕酮)、代谢物产生(米索前列醇、尼卡地平和螺内酯)或两者兼而有之(卡培他滨、氯法齐明、地高辛、氢化可的松、洛伐他汀、霉酚酸酯、舒林酸和伏立诺他)。我们通过计算代谢物和非代谢物分布的Shannon熵来量化这种可变性，表示为HV。当半数供体代谢药物时，该指标最大(HV=1)，当药物一直或从未代谢时(HV=0)，该指标最小。在测试样本中，研究者观察到的变异范围很大，从1/20到19/20的供体被认为是与特定类型的药物消耗或代谢物生产的微生物相关代谢物反应。例如，在地高辛中，3/20的供体(HV=0.61)产生了具有统计学意义的已知代谢物二氢地高辛(图4C和4E)。而在临床上已知地高辛的微生物来源的代谢反应在个体间的差异已有数十年之久，其中药物显著减少为二氢地高辛和相关代谢物的情况只发生在一小部分患者身上。这些结果表明，该研究的筛查可以定量地评估在相同的体外条件下培养的个性化肠道微生物群落之间微生物来源的代谢反应在个体间的变异性。接下来，研究者认为仍然需要进行后续研究，以评估上述筛查结果是否与临床结果直接相关。 下一步，研究者试图确定在所筛查中的药物消耗是否可以通过相关代谢物的产生来解释。如果药物水平的变化主要是因为转化为检测到的代谢物，则药物消耗和代谢物产生之间应该存在显著的负相关，与化学计量质量平衡相对应。另一方面，如果没有这样的相关性，就意味着有其他未被解释的过程(例如，产生了额外的未知或无法检测的代谢物，初始代谢物转化为第二代谢物，或者细菌消耗了上述药物)。对于微生物来源的代谢可变的药物(至少有一种代谢物或初始药物的HV>0.5)，研究者计算了所有供体药物体外样品中药物信号和已知代谢物信号之和的Pearson相关系数。然后，通过t检验，使用Benjamini-Hochberg方法校正p值，并要求FDR校正p<0.01，来确定一种药物是否具有统计学意义上的相关性。以vorinostat和地高辛为例，我们发现代谢物的产生与药物消耗之间存在显著的负相关关系，这表明大部分药物消耗可以通过量化代谢物的产生来解释(图4F)。以伏立诺他和地高辛为例，研究者发现代谢物的产生与药物消耗之间存在显著的负相关关系，这表明大部分药物消耗可以通过量化代谢物的产生来解释(图4F)。另一方面，尼卡地平最初表现出非常差的相关性(Pearson相关系数为0.22)，这意味着更多的未知因素在起作用。有趣的是，研究者的非靶向代谢组学检测到另外11种尼卡地平的代谢物，这些代谢物在纳入分析后导致了更强的负相关性(Pearson相关系数为0.6，FDR校正p=0.0102)(图4G)。因为该研究开发的筛选是基于微生物群落而不是针对单个菌株，因此他提供了一个强大的平台来发现在现实条件下影响药物和代谢物水平的相互作用因素-例如每个个性化群落观察到的不同数量的尼卡地平代谢物。上述结果强调了在微生物来源的代谢反应中考虑整体群落效应的重要性。虽然该研究中的体外群落培养模式可能不能完全概括所有可能发生在人体中的微生物群落效应，但其至少代表了识别和量化上述复杂群落的重要一步。 5 基于同源性的方法表征微生物来源去糖基化反应的遗传基础 为了鉴定一种基于同源性的特定微生物来源分离物，研究者探索了有限的细菌分离物(包括最初从供体中分离的菌株)对卡培他滨去糖基化的能力。有趣的是，卡培他滨的去糖基化反应主要是由变形杆菌(包括大肠杆菌)完成的，以及两个被测试的拟杆菌门中的一个:Parabacteroides distasonis，为功能研究提供了遗传上容易操作的微生物。为了检测人体胸苷磷酸化酶(thymidinephosphorylase,TP)或尿苷磷酸化酶(uridinephosphorylase, UP)的细菌同源物是否与观察到的卡培他滨的去糖基化反应有关，研究者使用了TP(DdeoA)和UP(Dudp)基因敲除的E.coli BW25113 敲除株，并比较了它们与野生型(WT) E. coli代谢卡培他滨的能力(图5A)。当WT E. coli有效地去糖基化卡培他滨(转化率为30%)时，Dudp和DdeoA/Dudp敲除株的脱糖活性显著降低(转化率低于4%)(图5B)。然而，与WT相比，DdeoA菌株的脱糖活性显著提高(转化率为50%)，这可能是因为在没有deoA的情况下存在一种补偿机制(例如，过表达udp)。这些结果表明，微生物群衍生的尿苷磷酸化酶至少在一定程度上与卡培他滨的脱糖基化反应有关。 卡培他滨是抗代谢化疗药物之一，其中许多是5-FU的前体药物，统称为口服氟嘧啶类药物(fluoropyrimidines,FPs)。口服FPs的生物利用度和毒性在患者之间差异很大，而肠道微生物对这种差异的贡献尚未探索。在本研究中，研究者发现在氟嘧啶中TP/UP具有一定程度的去糖基化特异性(图5C)。值得注意的是，根据测试药物的不同，相同修饰的结果也不同。对于氟尿嘧啶，生成的代谢物(trifluridine,三氟尿苷)是没有活性的：三氟尿苷通常完整地结合到DNA中，从而引起细胞毒性。然而，对于多西氟尿嘧啶(doxifluridine)，产生的代谢物是活性5-FU(图5E)。因此，这种前药的过早激活可能再次导致胃肠道毒性，这种副作用通常与口服多西氟尿嘧啶有关。 研究者将来自队列样本的粪便宏基因组读数映射到deoA和UDP的DNA序列，并计算出两个度量：即每个队列中对给定基因呈阳性的受试者的百分比，以及阳性样本中该基因的丰度。有趣的是，研究者发现这两个基因在非西方人群(中国人的deoA/udp阳性率分别为74%/76%和斐济人群的64%/70%)中最常见，而西方的人群(deoA/udp平均分别为24%/26%)，而且每个阳性样本的丰度在队列内和队列之间变化很大(图5F,5G)。这些结果表明氟嘧啶去糖基化酶在不同人群的肠道微生物群中分布广泛且多种多样(即使考虑到单个细菌物种大肠杆菌的贡献)，并进一步强调了在临床研究中考虑氟嘧啶类药物的微生物来源去糖基化代谢反应的重要性。 6 一种鉴定代谢酶的非靶向功能宏基因组筛选方法 虽然基于同源性的方法在确定氟尿嘧啶去糖基化的负责物种和酶方面相对简单，但该方法并不能在实际研究中广泛适用。与嘧啶磷酸化酶不同，氧化还原酶(可能导致氢化可的松还原为20 b-二氢可的松)的种类极其多样，而且通常是底物特异性的，每个细菌基因组中都发现了大量的同源物。此外，基于同源性的发现，以及比较转录组学和高通量突变筛选，通常需要鉴定进行修饰的分离菌株，并将其用作遗传操作或功能分析的基础。这两个限制因素促使研究者采用正交策略，这种策略既不依赖于同源性酶，也不依赖于分离的菌株。 虽然之前没有人的肠道微生物来源酶被认为是将氢化可的松转化为20 b-二氢可的松，但一种从猫粪便分离株Butyricicoccus desmolans ATCC 43058 含有20 b-羟化类固醇脱氢酶(20b-HSDH)。在研究者从供体粪便DNA生成的深度宏基因组测序数据集中，既不能识别这种酶，也不能识别其相近的同源物(蛋白序列为60%或以上)。因此，研究者决定用这个例子作为开发代谢酶的非靶向功能宏基因组筛选策略的测试案例。在典型的功能宏基因组筛选中，宏基因组DNA被克隆到载体中，在E. coli中复制，功能筛选以选择性的方式或视觉读出进行。在本研究中，研究者们使用功能宏基因组筛选，其中通过质谱检测到的是特定的微生物来源的代谢转化。在E. coli中成功表达的宏基因组基因并产生相应功能基因，这种方法可以获得由微生物已培养和尚未培养的细菌编码的酶，以及那些与之前表征的酶没有密切同源性的酶。然而，这一策略面临的两大技术挑战是：产生一个足够大的宏基因组文库，以捕获复杂微生物组中的大部分遗传内容；开发一种高通量的分析方法，以筛选上述文库。 研究者从供体中提取了宏基因组DNA，并用它在E.coli表达载体(插入大小为2-4 kbp)中构建了约3´106个成员的克隆文库(PD-CL)(图6A)。为了确定克隆文库是否真正代表供体的遗传信息，研究者对一个包含约105个独特克隆的代表性克隆文库(PD-CL-100)进行了深度测序，并将其与深度测序的供体粪便宏基因组进行了比较。研究者将来自供体或PD-CL-100的宏基因组阅读映射到来自供体宏基因组的组装数据。结果发现，从Pd-CL-100(仅占完整克隆文库的3%)读取映射到21%的供体数据，包括来自所有主要细菌门和供体微生物组中不同覆盖物的数据信息(图6B)。这些结果表明，PD-CL代表了供体中遗传信息的很大一部分，并足以用于功能宏基因组学的后续筛查。 在构建克隆文库的过程中，研究者将其分成80个模块，每个模块约有2-6 ´104个独特克隆(uniqueclones, UCs)，并将其保存在相应的甘油管中。研究者测试了这些模块中的每一个将氢化可的松转化为20 b-二氢可的松的能力，并确定了6个表现出显着新陈代谢的文库。为了获得单个功能克隆，研究者对选定的2´104 UCs阳性模块进行了10倍梯度稀释，然后以96孔板的形式筛选单个克隆，以获得单个阳性克隆：Hyd-red-1 (图6C)。针对Hyd-red-1的序列分析表明，它可能来源于一个双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)。对Hyd-red-1的遗传背景的分析显示，在克隆的插入片段中有一个氧化还原酶(图6D)。接着，研究者克隆并异源表达该单基因，结果表明它确实是一个20b-羟化类固醇脱氢酶(图6C和6D)。以类似的方式进行的第二轮克隆文库筛查发现了一个不同的克隆，Hyd-red-2，含有相同的基因，并证实了上述发现(图6D)。这些结果表明，将微生物来源的代谢筛选与功能宏基因组学方法相结合是将微生物来源的代谢转化与来自不同细菌的代谢酶联系起来而不需要分离细菌的一种有效分析策略。 然后，研究者试图进一步探索发现的20b-羟化类固醇脱氢酶的生物学相关性。因为它是通过供体菌群衍生的DNA在大肠杆菌中异源表达而发现的，所以研究者想知道它是否真的在宿主定殖条件下表达。为了解答这个问题，研究者从供体中提取RNA，对其进行深层的宏转录测序，并将结果映射到含有20b-羟化类固醇脱氢酶基因的供体数据中。研究者发现20b-羟化类固醇脱氢酶基因在供体来源的转录本数据中有很强的表达，但没有邻近基因的表达，这表明它是单独表达的，而不是作为基因簇的一部分(图6E)。为了进一步确定已鉴定的20b-羟化类固醇脱氢酶是否是供体菌群特有的或在人体中广泛存在，研究者将上述6个队列中的粪便宏基因组读数映射到其基因的DNA序列和以前从肠道微生物分离株Clostridiumscindens ATCC 35704中鉴定的20a-羟化类固醇脱氢酶(将氢化可的松转化为20a-二氢可的松)基因的DNA序列进行比较。结果发现，Clostridium scindens来源的20a-羟化类固醇脱氢酶基因很罕见(平均只在0.6%的受试者中存在)，而供体菌来源的20b-羟化类固醇脱氢酶基因在所有队列中都普遍存在(平均在36%的受试者中存在) (图6F和6G)。 7 微生物来源的体内去糖基化反应 虽然微生物来源的代谢反应筛查能够发现新的微生物-药物的相互作用，但这些体外观察结果是否真正可以在哺乳动物宿主的胃肠道内重现目前尚不清楚。为了解决这个问题，研究者试图在氟尿嘧啶体内药代动力学研究中监测这种微生物来源的代谢反应转化，该研究是以微生物组依赖的方式进行的。卡培他滨是微生物来源的代谢反应筛查最初的热门药物之一，它的修饰产生了一种新的代谢物(去糖基卡培他滨)，这是以前在人类或动物中没有报道的。研究者选择了它的微生物来源的去糖基化反应作为体内研究的案例。研究者给两组C57BL/6小鼠用抗生素的鸡尾酒疗法处理14天，以消除其原有的微生物群落，然后用供体菌群移植一组小鼠，而对照组保持非移植状态。然后，两组小鼠分别口服等量的卡培他滨(755 mg/kg)，分别在给药后0、20、40、60、120和240 min采集血液和粪便样本(图7A-B)。然后，研究者使用HPLC-HRMS对一系列粪便和血液样本中卡培他滨及其代谢物进行量化。在血液样本中，卡培他滨和它的主要肝源代谢物(50-脱氧-5-氟胞苷)，而非去糖卡培他滨，很容易被检测到，并且在两组之间没有显着差异。然而，在粪便样本中，早在给药20 min后，在移植供体菌群的小鼠中可以检测到去糖卡培他滨，在没有移植的小鼠中几乎完全不存在(图7C)。上述结果表明，至少在氟尿嘧啶脱糖基化的情况下，微生物来源的代谢反应在体外观察到的微生物的转化可以在体内(小鼠)重现，而在人体中进一步建立同样的结果还有待研究。 结论 在目前的研究中，研究者开发了一种定量的筛选平台，使用微生物培养、小分子结构解析、定量代谢组学、功能基因组学和宏基因组学以及小鼠体内定殖分析相结合的方法来评估人体肠道微生物直接代谢口服药物的能力。其中，几个关键的不同之处使该研究的方法有别于这一领域之前的研究。首先，在进行初始筛选时，研究者不是依赖单一的分离菌株，而是使用特征明显、个性化的微生物群落。尽管在分批培养中表征和保持稳定的微生物群落存在一定的技术挑战，但有三个主要优势使这一方法得以实行： (1)单独培养的单个分离株所进行的生化转化的程度可能与作为复杂群落的一部分培养的相同分离株所进行的生化转化的程度不同； (2)微生物组的几种菌株对同一药物作用的最终结果只能在混合菌群中来确定，而不能在单分离实验中确定，除非对所有的成对和更高阶排列进行测试； (3)该研究的策略是具有“个性化的”，因为研究得出的结果是针对每个供体的微生物组的菌株水平的。 因此，微生物衍生的代谢筛选在评估MDM的个体间变异性方面有很大的潜力。其次，以前的大多数研究都集中在某些药物和物种的组合上，这些药物和物种通常被认为是重要的或者是实验上可以控的。而该研究的微生物群落设置可以筛选到更广泛的组合，这使得研究者能够在药物的选择空间上进行扩展，并发现以前从未报道过的药物-微生物组之间的相互作用。本研究中，接近三分之二的测试药物被至少一种分离培养物显著消耗，这进一步强调了肠道微生物代谢口服小分子药物的巨大潜力。 具体来说，该研究分两个阶段来开发上述筛选系统。研究者从单个人体菌群样本开始，用575种药物在体外与其进行孵育培养。然后开始高通量筛选，采用更严格的方法进行培养基选择、药物和代谢物定量以及代谢物发现，并使用这些方法对20名人体捐赠者的体外培养物和23种药物进行筛选。同时，需要扩展到数百种药物和数百个供体样本，才能显示MDM的完整生化潜力，该研究中所发现的MDM转换类型很可能低估了所有可能的MDM转换。随着高通量筛选的实验方法和自动靶向和非靶向代谢分析技术的发展，该研究已经为这一扩展奠定了基础。最后，从临床角度来看最重要的一点是，对同一组供体的药物代谢结果和MDM筛选系统的直接比较对于确定在人体中可以观察到哪些MDM转换非常重要，而该研究从微生物群落和代谢变化的角度开发的定量框架提供了进行这种比较研究的必要工具。 评论 在目前的药物递送方式中，口服给药是其中最为常见的给药途径。药物一旦离开胃，可以在小肠或大肠中被吸收，到达体循环，最终到达肝脏，或者直接通过门静脉运输到肝脏。即便是非肠道给药途径的药物及其代谢物也可以通过胆汁分泌到达肠道内。因此，无论是吸收之前还是吸收后，某些药物都会在人体肠道微生物所在的小肠和大肠内停留相当长的时间。因此，研究肠道微生物的组成和功能，特别是当其与药物相互作用有关时是十分重要的，同时研究者也需要考虑到不同个体之间的巨大差异。 一般来说，微生物可以直接或间接地与药物相互作用。其中，间接相互作用包括微生物组衍生的代谢物和药物对同一宿主代谢酶的竞争、抗肿瘤免疫治疗中微生物对免疫系统的影响、药物分泌的非活性代谢物的可以被微生物重新激活以及微生物对肝脏和肠道中代谢酶水平的总体影响。而直接相互作用则包括通过微生物衍生的酶将药物部分或全部转化为活性代谢物(这里称为微生物衍生代谢，简称Microbiome-DerivedMetabolism, MDM)。人体肠道微生物包含上千上万种细菌，其编码的基因比人类基因组多100倍。这种巨大的多样性和丰富性可能暗含了一系列尚未确定的生化反应，使得它们能够代谢人体摄入的一些化学物质。尽管在过去的50年里，MDM已经在数十种药物的代谢过程中被观察到，但在药物的开发过程中以及在确定MDM在药代动力学中的具体作用方面，相关研究少之又少。这是因为人体微生物自身的巨大复杂性，以及在多种条件下测试数百种药物与数千种培养的分离菌株之间的巨大技术挑战。与肝源性代谢相比，目前，研究者缺乏系统和标准化的MDM图谱，这也极大阻碍了相关研究团队能可靠预测并最终靶向调整对药物代谢动力学和药效学有不良影响的微生物的能力。为了解决这一技术鸿沟，本文的研究团队开发了一种定量的实验筛选系统，使用个性化的肠道微生物衍生代谢筛选技术来检测口服药物的MDM。该研究所开发的筛选平台以及相关的研究成果为今后的研究提供了一个框架，可以用于发现MDM相关的新的相互作用，以及在药物开发过程中引入“MDM模块”来更加精准的研究药物在体内的复杂代谢过程。
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