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编译：逍遥君，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 膳食纤维（Dietary fibers，DFs）通常被认为对人体有益，并可改善肠道微生物组。然而，目前尚不清楚是否可以通过具有离散化学结构的DFs实现对肠道菌群的精确和可预测的操作，尤其是对肠道菌群的代谢活性。 本篇文章通过在健康人体中使用三种IV型抗性淀粉（Resistant starches，RS4s）进行剂量反应试验，结果发现结晶和磷酸盐交联淀粉结构诱导对产丙酸盐或丁酸盐微生物组组成产生不同且高度特异性的影响。RS4诱导的显性效应在处理组内非常一致，在35 g/天剂量下达到剂量依赖性平台期，并且可以通过具有不同淀粉代谢途径的细菌分类群对RS4s的底物特异性结合和利用来解释。总的来说，这些发现支持了利用离散DF结构实现肠道微生物组及其与健康相关的代谢功能靶向操作的潜力。 论文ID 原名：Precision microbiome modulation with discrete dietary fiber structures directs short-chain fatty acid production 译名：膳食纤维或可精确调节短链脂肪酸产生菌 期刊：Cell Host&Microbe IF：15.923 发表时间：2020.1 通讯作者：Jens Walter 作者单位：阿尔伯塔大学 实验设计 结果 1 不同RS4s干预效果存在差异 为了比较三种RS4s（玉米、马铃薯或木薯来源）和一种可消化玉米淀粉（安慰剂）对人类粪便菌群的影响，在40名健康个体（每组n=10）中进行了一项随机双盲、安慰剂对照、平行四组剂量-反应研究（图1A）。玉米RS4（VERSAFIBE 2470）是通过高直链淀粉的退火和酸处理生产的（导致重组淀粉颗粒），马铃薯RS4（VERSAFIBE 1490）和木薯RS4（VERSAFIBE 3490）通过磷酸盐交联天然淀粉（生成淀粉间酯键）生产。受试者食用淀粉4周，期间DF逐渐每周增加至10、20、35和50 g/天，以及等量的安慰剂（图1A）。 3例受试者因时间限制（木薯RS4，n=1）和忘记补充剂（马铃薯RS4，n=2）而退出研究，因此将其划分为额外的受试者并随机等分至这些组（图1B）。数据分析仅限于完成方案的40例受试者，包括20例男性和20例女性（每组5例），年龄为28.4±8.1岁，体重指数为24.0±3.2 kg/m2。干预期间，人体测量学、体力活动、感知压力和饮食摄入量没有变化。 图1 研究设计和流程图。（A）人体试验的研究设计，（B）受试者招募流程图。 2 高剂量RS4显示可接受的GI耐受性 所有治疗组复合GI耐受性评分（恶心、肠胃气胀、腹胀、GI异响、腹痛和腹泻总和，评分越高表示耐受性越差）均增加，并观察到明显的剂量效应。在35 g/天剂量下，玉米和木薯RS4s以及安慰剂（可消化淀粉）导致复合耐受性评分中度但显著增加1.6-2.8分（p < 0.05）。相比之下，马铃薯RS4不影响综合耐受性评分，组间无差异（治疗效应p = 0.19）。在评估的6种GI症状中，RS4治疗显著影响胃肠胀气、腹胀、GI异响和腹痛。 在一项单独的调查中，评估了RS4对排便习惯的影响（即频率、稠度、粪便硬度、用力、不适和排便不完全）。与正常基准线相比，仅马铃薯RS4诱导肠运动频率轻度，且显著增加（50 g/天），并降低35 g/天的粪便硬度。马铃薯RS4增强通便作用，因为通便作用主要归因于不可发酵的DF，因而可能是由于马铃薯RS4基本未被肠道菌群发酵。总体而言，这些结果表明，无功能性GI疾病的现代人类能够耐受高达50 g的RS每日高剂量，因为仅检测到GI症状的轻度至中度增加和排便习惯的微小变化。 3 RS4s对肠道菌群组成的影响差异显著 3.1总体粪便微生物区系组成和多样性 通过16S rRNA基因测序对粪便细菌群落进行表征。与基线和安慰剂相比，玉米和木薯RS4s增加了微生物组组成（β-多样性）的受试者间变异（个体性）（p≤0.003；图2A）。对于玉米RS4，20 g/天剂量下的受试者间变异增加。相比之下，木薯RS4在10 g/天剂量下受试者间变异降低，但在50 g/天剂量下增加。 然后，测试了RS4的消耗是否对微生物群组成产生影响。Bray-Curtis距离的非度量多维标度分析显示，与基线和安慰剂相比，食用玉米和木薯RS4s的个体粪便细菌群落存在差异（p<0.05）。与安慰剂相比，木薯RS4在35和50 g/天剂量下均使受试者β多样性显著变化（图2B）。 与基线和安慰剂相比，玉米和木薯RS4分别降低了20 g/天和35 g/天剂量下细菌群落的α-多样性（Shannon指数）（p<0.05；图2C和2D）。对于两种RS4s，α-多样性的降低是因为群落均匀度的降低（图2E和2F），而不是组内或组间操作分类单元（OTU；序列相似性为98%）的减少（图2G和2H）。 图2 不同RS4s和安慰剂对粪便细菌多样性的影响。（A）每个剂量/时间点受试者的粪便微生物组（个体间β多样性）与（B）基线和治疗期间（个体内）。小提琴图显示了各剂量下粪便细菌群落的α多样性，显示为（C）Shannon指数、（E）Pielou均匀度指数和（G）总操作分类单位（OTU）。小提琴图显示了各剂量下多样性相对于基线的变化，显示为（D）Shannon指数、（F）Pielou均匀度指数和（H）总OTU。 总体而言，肠道微生物组分析表明，较高剂量的玉米和木薯RS4通过增加个体间变异、改变群落组成和降低群落均匀度来改变粪便细菌群落。安慰剂和马铃薯RS4不影响β-或α-多样性，因而后者可能在很大程度上未被发酵。 3.2 粪便微生物区系的分类学组成 与在β-和α-多样性中观察到的变化一致，玉米和木薯RS4改变了细菌分类群的相对丰度，而马铃薯RS4和安慰剂几乎未检测到影响（图3）。玉米RS4富集了与Eubacteriumrectale（OTU1）、Oscillibacterspp.（OTU559）和Ruminococcusspp.（OTU27）相关的OTUs。相反，木薯RS4富集了Porphyromonadaceae科、Parabacteroides属和与Parabacteroidesdistasonis（OTU21）、Parabacteroidesspp.（OTU49）、Faecalibacteriumprausnitzii（OTU32）和Eisenbergiellaspp.（OTU9）相关的OTUs。这些富集均具有底物特异性，但在木薯RS4中也观察到E.rectale和Oscillibacter spp.的非显著性增加。此外，Bifidobacteriumadolescentis（OTU3）对玉米和木薯RS4均表现出接近统计学显著性（q < 0.07）的富集。 玉米RS4减少了与Ruminococcuscallidus（OTU57）、Agathobaculumbutyriciproducens（OTU84）和Adlercreutziaequolifaciens（OTU100）相关的OTUs。木薯RS4减少了与Eubacteriumhallii（OTU67）和Clostridiumviride（OTU132）相关的OTUs（图3）。总的来说，这些发现表明，玉米和木薯RS4之间结构的差异选择性地增加了特定OTUs的适合度。 图3 RS4s和安慰剂作用下细菌分类群和CARG丰度的变化，显示出显著的总剂量和/或相互作用效应的门、科、属和OTU的平均log2转换的相对于基线的倍数变化的热图（未校正的p<0.05；双因素rANOVA）和鉴别的共丰度响应组（CARG）。 3.3 共丰度响应组的鉴别 使用共生网络分析评估细菌分类群对50 g/天剂量反应的潜在相互作用。分析显示，受RS4处理影响最大的55个OTU聚为7个共丰度响应组（CARG）。正如OTU丰度的变化所观察到的，CARGs中的反应也是底物特异性的。玉米RS4增加了CARG6的相对丰度（图3），其中含有E.rectale作为唯一显著富集的OTU。相反，木薯RS4增加了CARG1的丰度，其中含有已知利用淀粉的P. distasonis和双歧杆菌属（B.olescentis[OTU3]和B.angulatum[OTU68]）和CARG4（其中Eisenbergiellaspp.作为唯一显著富集的OTU）。玉米和木薯RS4分别在35 g/日和50 g/日时降低了CARG7的丰度。 总体而言，CARG分析显示玉米和木薯RS4诱导的富集具有高度底物特异性，而检测到的减少具有较低的底物依赖性。此外，CARG1含有几种相互关联的副拟杆菌和放线菌（双歧杆菌和Collinsella）。 4 粪便SCFA的变化 尽管RS4未改变总SCFA浓度，但不同RS4对单个SCFA的影响不同。组内比较显示，与基线相比，玉米RS4选择性增加丁酸的浓度（p=0.05）和相对比例（总SCFA的百分比）（p=0.015），尤其是在35 g/天剂量下（图4A）。相比之下，在35 g/天剂量下，与基线相比，木薯RS4增加了丙酸盐浓度（p=0.04）。组间比较证实了这些结果，表明玉米RS4提高了丁酸的相对比例（p=0.037），同时降低了丙酸的比例（p=0.001）。与玉米RS4相比，木薯RS4增加了丙酸盐浓度（p=0.02）（图4B和4 C）。安慰剂（可消化淀粉）和马铃薯RS4均未改变SCFA水平或相对比例。 当考虑所有治疗组时，在35 g/天剂量下检测到总分支和个别SCFA（BCFAs；异丁酸和异戊酸）浓度降低（剂量效应p≤0.014，图4A）。观察到木薯RS4的BCFAs和SCFA之间的比值显著降低，尤其是在35 g/天剂量下（p=0.005），而相对于基线，玉米RS4的降低接近统计学显著性（p=0.07）（图4D）。当组间比较时，与马铃薯RS4和安慰剂相比，木薯RS4降低了BCFA与SCFA的比值（p≤0.02）（图4E）。总之，玉米和木薯RS4s似乎均以特异性上调糖分解发酵，SCFA（即丁酸盐或丙酸盐）显著升高，而指示蛋白水解发酵的BCFAs显著降低。 图4 通过RS4s和安慰剂处理（A-C）SCFA浓度（mmol/g粪便）相对于基线的平均log2转换倍数变化以及乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐相对于总SCFA的相对比例的热图调节粪便SCFA。考虑所有剂量（B）浓度和（C）SCFA相对比例（%）的较基线平均（+SD）变化的条形图。（D和E）各补充剂量下（D）总支链短链与短链脂肪酸（BCFA:SCFA）的比值以及所有剂量下BCFA:SCFA相对于基线的（E）平均（+SD）变化。符号代表单个样本；线代表平均值±SD。 5 RS4s的作用具有剂量依赖性 为了检查RS4剂量-反应关系，对剂量（即0 g/天至50 g/天）与OTU丰度（相对丰度平均增加>0.75%）、所有CARG和SCFA浓度之间进行了Spearman相关性分析（图5A）。与上述检测到的底物特异性效应一致，玉米RS4的剂量与直肠肠球菌（OTU1；rs=0.34，p=0.015）、CARG6（rs=0.26，p=0.066）和丁酸盐（rs=0.31，p=0.03）呈正相关，而木薯RS4的剂量与P.distasonis（OTU21；rs=0.39，p=0.005）、CARG1（rs=0.33，p=0.019）和丙酸盐（rs=0.28，p=0.049）呈正相关。马铃薯RS4或安慰剂未检测到剂量-反应关系。 为了进一步了解RS4剂量依赖性效应的程度，绘制了所有时间点OTU（增加>0.75%）、CARG和SCFA的平均丰度或浓度，以及这些变量相对于之前时间点的绝对变化。如图5B和5C所示，玉米RS4富集的所有OTU，以及OTU3（B.adolescentis）和CARG6的增加，均表现出在35 g/日时达到平台期的平均值。由木薯RS4以及OTU3富集的3个OTU（OTU21、OTU49和OTU9）也观察到35 g/日的平台期。而OTU32（F.prausnitzii）与木薯RS4的增加在10 g/日时达到峰值，CARG1的增加在所有试验剂量下均未达到平台期。有趣的是，玉米和木薯RS4分别诱导的丁酸和丙酸浓度增加，也表明在35g/天达到平台期（图5D）。总体而言，这些发现表明RS4诱导的对肠道菌群的影响具有剂量依赖性，其中大多数变量的平均反应在35 g/天的剂量下检测到玉米和木薯RS4s的平台期。 图5 RS4处理对粪便细菌组成和功能的剂量依赖性影响。（A）使用剂量（即0g/天-50g/天）和OTU丰度（平均富集>0.75%相对丰度）、所有CARG和主要SCFA浓度（mmol/g粪便）之间的Spearman相关性评价剂量-响应关系。（B-D）线形图显示了（B）OTU、（C）CARG和（D）SCFA的剂量响应（平均值）。气泡图显示了剂量之间的变化，其中红色和黑色圆圈分别代表正变化和负变化，圆圈大小代表变化幅度。 6 RS4用量的个体化效应 如既往RS干预研究所述，观察到的效应显示为个别化，如B. adolescentis（OTU3）、副拟杆菌属（OTU49）和Eisenbergiella spp.（OTU9）的增加，然而，检测到的一些结果非常一致。例如，10名受试者食用玉米RS4均富集了E.rectale（OTU1），而9名受试者CARG6增加。木薯RS4的主要作用也是一致的，所有受试者中P. distasonis（OTU21）富集，除1名受试者外，所有受试者中CARG1均增加。然而，这些反应的幅度是个别化的，E. rectale较基线增加53%-535%，P.distasonis较基线增加116%-21183%。玉米RS4的丁酸盐 增加也相当一致，除2名受试者外，所有受试者的丁酸盐相对比例均增加。木薯RS4仅在6例受试者中增加了丙酸盐的相对比例。但是，必须考虑到其中一些由于宿主吸收，检测结肠SCFA生成变化的灵敏度较低的误差。 个体剂量-反应曲线评估显示，尽管大多数效应的平均值在35 g/天达到平台期，但个体间最大效应的剂量不同。例如，在近三分之一的受试者中，50 g/天剂量可持续增强玉米RS4对E.rectale、CARG6和丁酸盐以及木薯RS4对P.distasonis、CARG1和丙酸盐的作用。 总的来说，这些发现表明RS4s的主要底物特异性和剂量依赖性效应非常一致（例如CARG1、CARG6、OTU1和OTU21）。然而，研究结果也强调，组成和功能反应的大小，以及达到这些效应所需的DF剂量，均有一定的差异。 7 RS4诱导的SCFA丰度变化与对细菌分类群影响的相关性分析 为了确定RS4诱导的SCFA丰度变化是否与对细菌分类群的特定影响相关，进行了Spearman相关性分析（图6）。玉米RS4诱导的丁酸比例变化与E.rectale增加（OTU1；rs=0.41，q=0.07）和主要产丁酸盐菌呈正相关，与R. bromii增加呈负相关（OTU7；rs=-0.49，q=0.02）。相反，木薯RS4诱导的丙酸盐比例变化与Eisenbergiellaspp.的增加呈负相关（OTU9；rs=-0.55，q=0.007），而与重要的产琥珀酸菌P.distasonis（OTU21；rs=0.49，q=0.03）的增加呈正相关。在整个数据集中也可检测到组内的几种相关性：丁酸盐变化与E. rectale变化相关（rs=0.29，q=0.004），丙酸盐变化与P.distasonis变化相关（rs=0.30，q=0.004）。这些发现表明，SCFA丰度的变化是RS4s对微生物群成员的靶向和结构依赖性作用的结果，微生物群成员具有利用RS4和生成各自SCFA的途径。 图6 细菌丰度变化与SCFA相对比例变化之间的Spearman相关性分析（FDR校正）。 8 细菌选择性粘附和利用底物可解释RS4s的具体作用 为了确定导致RS4s底物特异性的机制，比较了来自淀粉分解物种的4个菌株的粘附和利用能力，这些菌株代表了玉米和木薯RS4富集的OTU：B.adolescentis IVS-1、E. rectale 17629、R.bromiiL2-63和P. distasonis 8503。分析表明，这些菌株结合和利用不同RS的能力不同。B.adolescentis IVS-1、R. bromii L2-63和P.distasonis8503在体外均能够粘附于所有RS4s的颗粒上，而E.rectale17629仅粘附于玉米RS4而不粘附于马铃薯或木薯RS4（图7A）。此外，尽管所有菌株均能够利用玉米RS4进行生长，但仅B.adolescentis IVS-1和P. distasonis 8503能够在木薯RS4上生长，而E.rectale17629、R. bromii L2-63不能（图7B）。总之，体外实验显示木薯RS4的粘附和利用存在底物特异性差异，这与体内研究结果一致，为人体试验中不同RS4s的特异性作用提供了潜在机制。 图7 采用相应RS4进行体外结合试验后，从RS4中回收B.adolescentis IVS-1、E. rectale 17629、R.bromii L2-63和P.distasonis 8503的代表性人肠源性淀粉分解细菌。（A）总CFU（CFU/mL）对RS4粘附性和利用情况的体外评估（平均值±SD）。（B）B.adolescentis IVS-1、E.rectale 17629、R.bromii L2-63和P.distasonis 8503在含0.2%指定RS4或无碳水化合物的YCFA培养基中的生长曲线（平均OD600）（对照）。 讨论 这项研究表明，DF之间离散的结构差异可以对肠道菌群的多样性、组成和功能产生实质性但截然不同的影响，从而导致一些细菌分类群的选择性富集。并且这些变化与SCFA向丁酸酯或丙酸酯的定向变化有关。RS4的主要组成和功能效应是剂量依赖性的，在总体人群中以35 g/day的剂量达到稳定。即使所有效应均显示个体间差异，但主要的RS4诱导的变化仍显著一致。 本研究结果表明，B.adolescentis和P. distasonis均与木薯RS4可较好的粘附并利用，而E.rectale完全不能。由于木薯淀粉颗粒制备时产生了淀粉酯间键，使其具有略微粗糙的纹理表面。根据体外研究结果可以推测酯键特异性地阻碍了E. rectale的利用，并促进了P.distasonis的竞争优势。交联小麦淀粉和丁酸酯化玉米淀粉也显示出对P.distasonis的选择性富集，这表明该物种拥有与酯化淀粉特异性结合的性状。尽管RS4s化学修饰的差异可能解释了微生物组反应的特异性，其他因素，如粒度，也可能起作用。 玉米和木薯RS4对微生物的影响具有显著的特异性——受一个RS4影响的大多数分类群与其他分类群、几个分类单元（P. distasonis、F.prausnitzii和Ruminococcus spp.）无响应，甚至表现相反（图3）。几乎所有丰度下降的分类群均受到两种RS4s的影响。其潜在机制是SCFA的生成增加，SCFA本身具有抗菌活性（例如醋酸盐和丙酸盐），也酸化环境，抑制pH敏感分类群（如脆弱拟杆菌）的生长。也有可能是SCFA上调噬菌体生成，这可能降低了群落中分类群的丰度。虽然离散的DF结构富集了肠道菌群的特异性特征（包括SCFA）；但减少（分类群和BCFAs）的特异性要低得多。 RS4治疗不仅调节肠道菌群组成，还调节其代谢。肠道菌群组成变化和反映生物体代谢能力的SCFA之间具有强相关性。RS4诱导的分类群显示与丁酸盐和丙酸盐代谢有很强的联系，E. rectale和P.distasonis分别编码丁酸盐和琥珀酸盐生成的代谢途径。SCFA与CARGs（即CARG6和CARG1）的相关性不显著，这表明RS4诱导的SCFA变化更依赖于单个分类群，而不是复杂的生态系统。尽管BCFAs的生理作用尚未阐明，但它们的减少确实表明RS4的发酵抑制结肠中蛋白发酵，这种作用被认为是有益的。总之，结果表明，可以开发离散的DF结构来指导特异性SCFA的输出与BCFAs的非特异性减少。 剂量效应研究设计使我们能够确定对RS4s表现出剂量依赖性反应的微生物组特征，以及使这些效应最大化所需的近似剂量。本试验只能推测检测到阈值，但生态系统可能被35 g/天的RS4达到饱和，其中分类群达到最大生长速率或经历限制其扩展的其他必需营养素的限制。尽管研究不允许对健康进行直接推断，但本研究的发现确实为量身定制DF的使用以增强与健康相关的预期效果提供了基础。这是有意义的，因为文献中绝大多数人体试验使用的DF剂量远低于35 g/天。 本研究揭示了使用RS4s进行微生物指导的干预以改善健康的重要见解。一般而言，玉米和木薯RS4s诱导的肠道菌群反应可能是有益的，以牺牲有害蛋白水解（即SCFA与BCFA生成）为代价增强糖分解发酵，而不减少分类群的总数。此外，该发现为更“智能”地使用玉米和木薯RS4实现对共生肠道群落的靶向操作以产生特定的健康终点提供了基础。这一策略可以进一步扩展到粪菌移植，目的是为预测提供益处的特定细菌物种的选择性生态位机会提供底物。例如，玉米RS4可能适用于纠正2型糖尿病中观察到的微生态失调，其中已证明E. rectale的丰度较低，该种属与血糖控制改善呈正相关。此外，丁酸盐的免疫调节特性使玉米RS4成为治疗和/或预防结直肠癌、炎症性肠病和肥胖相关炎症的候选药物。而木薯RS4可用于提升P.distasonis丰度。最近在小鼠中发现活的P. distasonis治疗可降低高脂饮食诱导的体重增加、高血糖和肝脏脂肪变性。由于其上调IGN和厌食激素，木薯RS4可进一步靶向丙酸盐治疗胰岛素抵抗和肥胖。玉米和木薯RS4的混合物可用于同时增加丁酸盐和丙酸盐的产量，这将与肥胖及其免疫代谢失调的治疗特别相关。 评述 该项研究通过对具有不同化学结构的DF对受试人群肠道菌群及代谢产物的差异分析，得到了一些新的见解，拓展了我们对DF特异性影响肠道菌群的了解。该项研究为支持具有离散DF结构的结肠菌群智能操作的机制框架提供了关键证据。利用DF化学结构的微小差异来实现对肠道微生物组的实质性、高选择性和可追踪效应的能力为开发精确方法铺平了道路。
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