|
编译：依然，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 克罗恩病(CD)的一个特征是肠外“爬行脂肪”(CrF)，定义为发炎和纤维化的肠道周围的肠系膜脂肪组织扩张。在目前的研究中，我们探索CD中的微生物易位是否是慢性肾功能衰竭发生的中心线索。我们在CD回肠手术切除的CrF中发现了一组粘膜相关的肠道细菌，它们在CrF中持续移位并保持存活，并鉴定出Clostridiuminnocuum是这个联合体的特征，粘膜和脂肪分离株之间存在菌株差异，这表明他们更喜欢富含脂质的环境。单细胞RNA测序表明CrF既是促纤维化的，又是促脂肪的，具有丰富的对微生物刺激有反应的活化免疫细胞环境。表达模式的体外验证表明，C.innocuum通过对M2巨噬细胞刺激组织重塑，导致脂肪组织屏障，防止细菌的系统性传播。 论文ID 原名：Translocation of Viable Gut Microbiota to Mesenteric Adipose Drives Formation of Creeping Fat in Humans 译名：可变的肠道微生物群向肠系膜脂肪的移位驱动人体蠕动脂肪的形成 期刊：Cell IF：38.637 时间：2020.10 通讯作者：Suzanne Devkota 通讯作者单位：美国雪松西奈山医疗中心 图文摘要 实验设计 1选取了11例因CD并发症接受手术切除的患者、13例无CrF的UC患者和4例非IBD结肠手术后行回肠造口的受试者的回肠段和肠系膜脂肪进行元基因组测序，比较其微生物组特征和功能。 2 从CD患者和UC患者的MAT、MUC中分离培养活的菌株，对C. innocuum进行全基因组测序和比较基因组学分析。 3 检测了各组样本中肠紧密连接分子(JAM-A), E-cadherin,Claudins 3,4, 7, Mucin 1 (MUC1), tricellulin 和zonulin-1 (ZO-1))的基因表达，研究肠道通透性改变与细菌移位关系；采用舍德勒菌群(ASF)饲养系统研究C.inonocuum是否移位到MAT上，及对MAT的影响。 4 通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和Bulk RNA测序来表征CD、UC和H-MAT中MAT的细胞环境，并寻找区分跨组织和疾病的细胞表型。 5 进行了免疫试验，将CrF和CD来源的C.innocuum的新鲜裂解物与健康志愿者的PBMC来源的巨噬细胞共培养，并测量了指示M1或M2极化细胞的细胞表面标记和细胞因子，验证C.innocuum在体外促进原代巨噬细胞和祖细胞的促纤维化表型。 实验结果 1 元基因组测序揭示了细菌易位现象，它发生在CD和健康MAT中，但轮廓和功能不同 作者选取了11例因CD并发症接受手术切除的患者，并从每个患者收集配对受累和相邻的未受累回肠段(CD iMUC和uMUC)、附着的CrF、相邻的未受累的肠系膜脂肪(CDMAT)及血液共5个部位样品 (图1C)。此外，我们还收集了13例无CrF的UC患者的类似区域、受累/非受累结肠(UC iMUC和uMUC)和UC MAT作为对照。我们还从4例非IBD结肠手术后行回肠造口的受试者的回肠粘膜(H Muc)、附着垫(H MAT)和血液中获得了健康组织对照(H Muc)和附着垫(H MAT)。这些样本的系统的处理和分析工作流程参见图1C。表S1详细说明了患者信息数据，包括临床特征、用药情况、家族史、社会史和研究队列的基本信息。我们对一组患者进行了深度鸟枪式元基因组测序，以首先评估在肠系膜脂肪中是否可以检测到细菌DNA，如果可以，这是CD患者特有的还是自然发生的。从CD(n=4名患者，4个组织部位)和H(n=4名患者，2个组织部位)的24份成对脂肪和粘膜样本(图1C)中，总共鉴定出2,803个组织分类群。通过使用Source-Tracker2方法，排除了MAT中的细菌足迹来自环境污染，确定了样本粘膜和脂肪序列与粪便样本的比对最接近(图2A)。 α多样性是区分CD和H样品的关键特征。尽管使用相同数量的脂肪组织构建文库，但H MAT与CD MAT相比细菌计数一直较低(表S2)，但H MAT在归一化后保持了比CD MAT更高的多样性(图2B，最左边)。这与CD iMUC中微生物多样性与对照组织相比降低的研究结果一致，作者在这里发现，粘膜多样性降低与MAT中更大的生物边界相关。受累或非受累部位的MAT和MUC之间CD内α多样性没有显著差异(图2B，左中和右中)。在组织对照中也观察到类似的情况(图2B，最右边)。β多样性分析表明，虽然我数据集中有很高的个体间变异性但样本的群落结构在很大程度上可以根据疾病和组织状况分开(图S1B)。我们使用MetaCyc通路研究了CD和H中元基因组的代谢潜力，并使用Songbird多项式回归对它们进行了排序。分析表明，与CD和H相关的微生物群对碳源和氮源有不同的偏好。特别是，CD组明显富含蔗糖利用的途径及与硫代谢有关的途径，而在H对照的微生物群中，则富集了与肠道健康有关的过程，如纤维发酵和维生素B6合成 (图2C)。 2 细菌和真菌模式区分组织间隔和疾病状态 虽然CD和H组之间的微生物存在差异，但这可能是一般慢性肠道炎症的指示，而不是CD的特定特征。因此，作者收集了另一类UC患者但没有发生Crf的慢性肠炎的样本，并进行了16SrRNA测序。然而，如元基因组数据所示，CD CrF和MAT，相对于配对的MUC没有显著差异，而UC组比MAT在MUC分类组上，以及所有CD样本具有更大的多样性(图2D)。这可能反映出与小肠相比，结肠的细菌含量更高。 为了进一步确定MAT中的细菌是否实际上来自肠道，我们将CD和UC在MAT中鉴定的分类群与它们各自的MUC进行了比较，并寻找重叠的分类群和离群值。使用Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)显示，在CD或UC切除中，MUC和MAT之间没有唯一的聚类(图S2A)，表明这些位点的微生物区系之间没有显著差异。在单个分类群水平上，MAT来源的细菌在CD和UC中都与MUC微生物群的成员进行了系统发育比对(图2E)，这表明MAT不是一个新的微生物生态位，而是从肠道转移到邻近的MAT。与相邻的CD MAT和下面的CD MUC相比，慢性阻塞性肺疾病的标本明显地表现出Erysipelotrichaceae的丰度的升高(图S2B)。除了细菌序列，在CD和UC的所有MAT标本中也发现了真菌DNA，但观测到的ITS数量没有显著差异(图2F)。PCoA显示，真菌群落在很大程度上是由标本位置(MAT与MUC)分开的(图S2C)，这表明虽然总体真菌多样性没有疾病或组织特异性，但群落结构反映了组织位置的差异。例如，Saccharomyces cerevisiae和Candida metapsilosis的相对丰度在MAT标本中都相对较高(图2G)，而Malassezia restricta则是CD MUC样本的标志菌株。 图2.MAT不同肠道来源的多样微生物群(A)SourceTracker2与HMP样本比较预测MAT细菌来源。(B)比较CD和H(左)的元基因组测序的α多样性；下列配对组织：CrFiIMUC(左中)，CDMAT和CD uMUC(中右)，以及HMAT和H MUC(最右)。(C)用Songbird多项式回归分析总CD对H组微生物群的通径分析。正值表示与CD相关。(D)CD和UC中MAT和MUC微生物区系的基于16S rRNA的扩增子序列变体(ASV)。(E)CD和UC切片中观察到的基于16S rRNA的细菌分类群系统发育树。点的垂直排列表示分类单元在多个采样点的共同出现。(F)CD和UC中MAT和MUC菌群基于ITS的ASV。(G)CD、UC、MAT和MUC中优势真菌信号的相对丰度。Kruskal-Wallis检验(A)。双侧Mann-Whitney U检验(B，最左边)。配对的Wilcoxon签名秩检验(B，从中到左到最右)。多重比较(D、F和G)的单因素方差分析和Tukey检验。统计意义(p<0.05)由每条条上不同字母表示。 3 回肠CD MUC和CrF具有独特的可培养微生物区系 为确定在MAT上鉴定的序列是否来可培养微生物，作者假设这些生物的基因组和功能特征可以为了解CrF的微环境提供有用信息。于是他们从9/11名CD患者和9/13名UC患者的MAT中分离了活的细菌，还从4/4H MAT对照中分离活细菌(图3A)。这样一共从CD和UC MAT中分离了229个菌，经测序分析鉴定后，可分类归属到84个物种中(表S4)。当将可培养细菌与扩增子测序鉴定的细菌重叠时，两种方法都可以检测到的有41种细菌，而其他的只能通过测序或培养来检测到(图3B)。例如，Akkermansia muciniphilia和 Faecalibacterium prausnitzii主要通过测序而不是通过培养检测到。这表明许多肠道微生物可以移位到MAT上，但只有一小部分细菌仍然活着，或者这些细菌在给定的菌体衍生条件下可能改变了与其类型菌株不同的代谢需要。我们从MAT上发现了两个活的真菌分离株，白色念珠菌和蚜虫假酵母菌，这两个菌只在两个CD患者中分离到。 当可培养的脂肪细菌按寄主状态分层时，我们发现了CD MAT所独有的五种细菌的亚群：Clostridium innocuum, Erysipeloclostridiumramosum, Parabacteroides distasonis, Clostridium symbiosum, 和 Bifidobacterium pseudolongum (图3A)。为了排除人为培养细菌的影响，作者考察了这个特征是否可以区分CD和健康组织，特别是区分元基因组数据集中的CrF和H MAT。 通过比较这些微生物的丰度，计算这5个CD专一性细菌的丰度与P.merdae丰度的对数比，此对数在元基因组测序基于Songbird多项式回归与健康对照的关联度最高，可以得出可培养的CD特征在CD和H组织之间有显著的区别(图3C)。 在这一CD联合体中，分离频率最高的是C.Innocuum。它的特征是革兰氏阳性菌，对万古霉素耐药，是共生微生物群中形成孢子的成员，是引起肠外梭状芽胞杆菌感染的第二常见物种，仅次于产气荚膜梭菌。有趣的是，可以从UC患者的MUC中分离出活的C.innocuum，但无法从他们的MAT中分离出，即使找到了其他活细菌(表S5.1)，证明了C.innocuum可以定植在回肠和结肠中，作者也无法从H MAT或者MUC中分离活的C.innocuum。 4 分离自不同组织C.innocuum的比较基因组和功能分析 作者对来自30个患者的MUC和MAT的C.innocuum进行了全基因组测序(WGS)，以模式菌株C.innocuumdsm 1286和C.innocuum 2959作为参考，以确定不同组织部位的菌株变异程度。结果显示各分离株之间最明显的系统发育差异是MUC和MAT来源的菌株之间的差异(图3D)。MUC和MAT分离株以及CD CrF和CD MATs分离株之间的KEGG通路存在差异，与感染性疾病、折叠、分类和降解、碳水化合物代谢和核苷酸代谢有关(图3e)。其中感染途径值得一提，它只有两个关键基因参与KEGG途径，即丝蛋白B(OGUc5301和c5312)和精氨酸酶(OGUc11046、c11199和c10216)(表S5.2)。这些特征表明，CD脂肪环境对最有能力调节宿主防御能力的C. innocuum施加了选择压力。 通过厌氧底物利用率测定考察具有系统发育相似性的C. innocuum是否在功能具有相似性。与WGS数据相似，该检测既揭示了核心功能特征，也揭示了可区分组织来源的可变特征。在保守功能中，除L-苯丙氨酸-9外，没有一株C. innocuum能有效利用氨基酸或它们的衍生物，而所有的菌株都能高效地代谢糖和糖衍生物，以及核苷酸及其衍生物(图3F)。尽管我们发现只有2/5的CD患者在其配对的CrF和MAT中有遗传分化的C. innocuum，但从功能上讲，从同一患者复活的CrF和MAT分离株都有不同的代谢偏好(图S3B，按患者分组)，且所有五名患者都符合该规律。除此之外，CD MUC和MAT分离株在底物偏好上的明显差异。具体地说，MUC分离株比MAT分离株能更有效地代谢丙酮酸，这可能反映了这些组织中的氧分压。这些数据显示了MUC和MAT分离株在基因组水平上的明显差异；然而，功能分析揭示了这些菌株细微差别的底物偏好，可能反映了CrF组织中为适应环境发生的变化。 图3.CDMAT有一个独特的、以Clostridium innocuum为优势种的可培养微生物群 (A)关键可培养微生物。图中显示了在不止一个样本中发现的细菌。每列代表单个患者的可培养群落。仅从CD、UC或H中回收的生物体以黑色为阴影。(B)维恩图，显示通过16S rRNA测序和培养方法鉴定的独特细菌种类的数量。(C)从CD样品中专门培养的五种细菌(C.Innocuum，E.ramosum，P.disasonis，C.symbiosum和B.seudolongum；图3A)到一种H-MAT专属细菌P.merdae的元基因组序列的成分相干对数比t测试，通过Songbird多项式回归鉴定。(D)分离自不同样本的C.innocuum的全基因组比较CDCrF(n=11)，CD MAT(n=6)、CDmucosa(n=8)和UC mucosa(n=5)，以及参考基因组C.inocuum2959和模式菌株DSM1286。样本的疾病和组织分布编码在右边。(E) C.innocuum分离株差异丰富的KEGG通路。R=参考菌株。(F)用Biolog体外底物利用试验对C.innocuum分离株进行功能表型鉴定。以95种不同的底物为唯一营养源，对每个菌株的生长情况进行了筛选。R=DSM1286型菌株。 5 尽管屏障功能受损，但CD中细菌产物的系统循环减弱 接下来，作者又考察了宿主环境如何促进CrF中细菌移位和脂肪扩张。首先推测细菌易位的变化是否可以归因于肠道通透性的差异，于是检测了CD iMUC和uMUC，UC iMUC和uMUC，UC iMUC和uMUC和以及H MUC样本中肠紧密连接分子(JAM-A), E-cadherin,Claudins 3,4, 7, Mucin 1 (MUC1), tricellulin, 和zonulin-1 (ZO-1))的基因表达(图4A)。与H组比较，CD和UC病例所有的生物标记蛋白，除了MUC1 外均显著降低。这与已报道的人类IBD中MUC1的过度表达是一致的。在每个IBD患者的配对样本中的比较显示，CD iMUC与CD uMUC相比，除MUC1和ZO-1外，所有检测到的屏障基因的表达都较低(图S3C)。尽管屏障基因在CD和UC受累组织中的表达持续受损，但CD患者的血浆脂多糖结合蛋白(LBP)和可溶性CD14(与血液中循环细菌产物的数量成比例相关的肠道通透性替代标志物)的测量结果与UC相比显著降低，与H MUC相比没有显著差异(图4B)。这可能反映了宿主的炎症状态，CD和UC疾病的区域差异，也可能是CD中CrF的存在抑制了炎症病变部位细菌的全身扩散。 6 无菌小鼠C.nonocuum易位到MAT并促进脂肪扩张 由于目前不能预测哪些新诊断的CD患者会发生纤维化并发症，而且手术切除仅发生在晚期病例，因此，无法前瞻性地观察这些患者的细菌移位和CrF的发生发展情况。也没有任何慢性肾功能衰竭的动物模型可以可靠地重述在人类中看到的现象。因此，作者利用无菌小鼠，采用改变的舍德勒菌群(ASF)饲养系统来研究C.inonocuum是否移位到MAT上，及对MAT的影响。 ASF小鼠一次性口服人CrF来源的C.inonocuum，并在灌胃后第4天确认其定植。在灌胃后第14天处死小鼠，同时处死灌胃PBS对照组小鼠。一组C.inonocuum灌胃的小鼠被给予 DSS以又到屏障功能受损。结果，我们观察到灌C.inonocuum的小鼠有大量的肠系膜脂肪，而对照组小鼠有微量的MAT，类似于典型的无菌小鼠(图4C)。观察到的MAT扩张似乎不是整体体重增加的结果，因为C.inonocuum并没有使体重增加 (图4D)。虽然正如DSS治疗所预期的那样，C.inonocuum+DSS组观察到明显的体重减轻，但与对照组相比，这些动物仍然表现出明显的脂肪肥胖症。结肠长度缩短是肠炎的一个指标，在两个组都有明显的观察到，C.inonocuum +DSS组更明显(图4E)。 通过对这些小鼠的MAT组织的培养，成功地分离出了灌胃的C.inonocuum，证实它可以从肠道转移到MAT，并发生在DSS处理组和未处理组(图4F，蓝色箭头，指向C.innocuum)，这表明炎症不是其移位的先决条件)。作者还证明了，与来自健康人体组织对照的培养数据类似，细菌移位到MAT在一定程度上是一种自然发生的现象。我们从对照组复活了八种ASF中的两种菌(图4F，左，黄色右排)，这表明并不是所有的微生物都有能力在肠外空间移位或存活，这与图3A和3B中的患者数据是一致的。有趣的是，C. innocuum的定植似乎促进了ASF内另外四个成员的移位(图4F，中间和右侧，黄色箭头)，在DSS治疗组也观察到类似的结果。 脂肪生成和组织纤维化相关基因的表达显示，单独灌胃C. innocuum的小鼠可上调FABP4、FASN、PPARG和CEBPA等脂肪生成相关基因的表达(图4G)。在C. innocuum +DSS组和对照组中未观察到这一现象。然而，常与脂肪纤维化有关的细胞外基质(ECM)成分IV型和VI型胶原在灌胃C.innocuum的小鼠±DSS中高表达(图4G)，提示C. innocuum在促进脂肪生成和细胞外基质产生方面具有一定的作用。 为了验证MAT的扩张可以减弱细菌产物的系统性传播的假设，作者测量了不同治疗组的血浆LBP。结果发现，与未经治疗的ASF对照组相比，单独服用C.innocuum的组的LBP水平相似(如果不是更低的话)(图4H)，这与人类队列的结果(图4B)有所不同。另一方面，DSS处理的小鼠，尽管C. innocuum移位和MAT扩张，但其LBP水平仍显著增加。鉴于急性DSS会导致整个小肠和结肠的损伤，微生物产物的渗漏或扩散可能发生在脂肪膨胀区域之外。这个实验中的低重复度值有一定的局限性)，然而这些数据代表了一个概念性的证明，即人的CrF来源的C. innocuum在进入具有简化微生物群的无菌小鼠后，可以移位到MAT上，促进脂肪的扩张。 图4..通过qRT-PCR检测CD、UC和HMUC的肠道屏障基因表达，C. innocuum移位促进了细菌LPS(A)肠道屏障基因的扩张和系统扩散。下面的点线代表与H MUC(H MUC，n=4；CD，n=10；UC，n=8)相比靶基因的下调。(B)血浆LBP和可溶性CD14来自与(A)相同的CD和UC。健康样本包括(A)中的H患者(开放符号)和另外10名健康献血者(H，n=14；CD，n=14；UC，n=11)。(C)灌胃PBS(左)、C.innocuum (中)和C. innocuum+DSS(右)的ASF GnotoBiotic小鼠回肠-肠系膜区域的代表性图像。黑色箭头指向MAT。(D)与基线相比，gnotobiotic小鼠体重的变化。未处理组(n=3)，C. innocuum组(n=2)，C. innocuum+DSS组(n=2)。(E)结肠长度。(F)从(C)小鼠的垫子中回收的易位细菌。箭头表示不同的细菌种类(代表菌株；黄色，ASF；蓝色，C.Innocuum)。(G)用qRT-PCR技术检测生药垫中的成脂作用和细胞外基质(ECM)标志物。(H) gnotobiotic小鼠的终点血浆LBP。采用Tukey的多重比较检验进行单因素方差分析。*p<0.001；*p<0.0001；#p<0.0001 7 CrF的细胞组成可被组织重塑的标记和不同的免疫细胞群来区分 为考察患者和对照组织中细菌移位到肠系膜的程度，作者还通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和批量RNA测序来表征CD、UC和H-MAT中MAT的细胞环境，并寻找区分跨组织和疾病的细胞表型。CrF和H-MAT的批量RNA测序显示，在检测到的42,606个基因中，有1,118个基因被鉴定为显著差异表达基因(DEG)，其中834个基因在CrF基因中上调，284个基因在CrF基因中下调(图5A；表S6)。正如预期的那样，在CrF中脂肪生成相关的基因上调了而下调了负调控因子 (图5B)。然而，通路水平分析表明，CrF中最大的转录变化不是与脂质代谢有关的功能，而倍增分数最高的基因与细胞对细菌产物的反应、吞噬、B和T细胞的分化和活化以及细胞外基质的产生和组织等过程有关(图S4)。这对应了CrF的主要特征是对细菌移位和纤维化的免疫反应。进一步深入分析，作者又对脂肪的stromal vascular fraction(SVF) 进行了scRNA-seq，包含免疫细胞、内皮细胞和祖细胞类型。 联合分析CrF和H MAT14个不同的细胞团(图5C，左)，主要由祖细胞(P1-P5)、免疫细胞和内皮细胞组成。当按组织来源(图5C，右)区分时，属于P3(FABP4+)的簇、两个T细胞亚群(T细胞1：CCL7+、CD62L+；T细胞2：CCL7、CD62L)、B细胞和感觉神经元几乎全部由CD CRF的细胞组成。相反，唯一能区分H MAT的细胞类型是P2(CD34+、FABP4+和PPARG+)和P4(ICAM1+)。这种与健康组织的比较证实CrF富含不同的免疫细胞。当CrF与其相邻的CD MAT在分离 (Figure5D，左侧)，出现了11种细胞类型，但几乎全部由两个部位的细胞组成。在这11个细胞中，有3个是祖细胞类型(P1-P3)，它们的表型与以前的分析不同，因为它们在FABP4或PPARG中没有明显富集。虽然T细胞仍然是最丰富的免疫细胞类型，但与H-MAT相比，它们的异质性较小，B细胞显著扩张。当用CrF或CD MAT(图5D，右)显示这些簇时，相同的脂肪来源的成纤维细胞簇区分了H MAT和CrF，也可区分CD MAT(P2，簇1)。有趣的是，这种细胞类型也区分了CrF和UC MAT(簇P2，图S5A)，表明这种祖细胞类型是回肠区域MAT所特有的。 图5 来自CD、UC和H的MAT的单细胞和批量RNA测序揭示了CrF(A)批量RNA测序生成的CrF与H MAT中差异表达基因(DEG)的热图中独特的细胞轮廓。显示了调整p值<0.05的基因。(B)特定基因在CrF和HMAT中的表达水平成倍变化，脂肪分化基因突出。调整后的p值<0.05的显著差显示为红色。(C)scRNA-seq生成的CrF和H MAT的UMAP图，区分单个细胞团(左)和组织来源(右)。用彩色线条表示的细胞类型的频率。(D)scRNA-seq生成的CRF的UMAP图和成对的CDMAT，区分单个细胞团(左)和组织源(右)。用彩色线条表示的细胞类型的频率。 基因集富集分析确定了与HMAT或CD MAT相比，CrF显著富集的途径(图6A和6B)。结果表明，与ECM产生相关的途径在祖细胞中有明显富集。这与大量RNA测序数据一致，虽然CrF富含脂肪合成基因，但ECM和免疫相关途径是最主要的(图S4)。巨噬细胞群体中富集的重要途径主要与微生物模式识别和向其他类型细胞发出信号有关。然而，巨噬细胞也是内皮细胞外唯一上调脂质分解代谢和生物合成途径的细胞类型，表明它们在CrF的组织重塑中起作用。 图6 上调的ECM和抗M微相关途径是CrF的优势表型 (A)与H-MAT相比，GSEA在CrF中表达不同的途径。每个细胞簇的前五条重要路径列在y轴上。(B)与相邻的CD-MAT相比，GSEA在CrF中表达不同的途径。Nes=归一化富集分数。大小=列出的每条路径的基因集的大小 8 C. innocuum在体外促进原代巨噬细胞和祖细胞的促纤维化表型 迄今为止的数据表明，CrF是一种由促纤维化的祖细胞、适应性免疫细胞和先天免疫细胞共同控制的组织，这些细胞似乎共同受到细菌易位的影响。为了测试C. innocuum是否特异性地诱导这些反应，作者首先进行了免疫性试验，将CrF和CD来源的C. innocuum的新鲜裂解物与健康志愿者的PBMC来源的巨噬细胞共培养，并测量了指示M1或M2极化细胞的细胞表面标记和细胞因子。这些实验中使用的C. innocuum菌株与无菌小鼠实验中使用的菌株相同。同时，测试了C.innocuum作为选定的CD特异性可培养细菌(E.ramosum、P.disasonis和B.seudolongum；图3B)的一部分，可使巨噬细胞极化，类似于单独使用C.innocuum。巨噬细胞在分化为M1或M2亚型时表现出形态变化，M1表现出典型的圆形、尖状形态，M2形成细长的纺锤体。事实上，当暴露在LPS和IL-4、M1和M2阳性对照中时，也可以观察到这些形态(图7A，显示的代表性图像)。当这些细胞单独暴露于C.innocuum时，它们表现出明显的拉长形态，而暴露于CD相关联合体的巨噬细胞则是异质的。 作者还在scRNA-seq数据集中使用了共表达的标准M1巨噬菌体标记，以及使用M2a/M2b/M2c亚集进行亚层化的M2标记来测量偏振态。在这些实验中，我们还从CD联合体中剔除了C.innocuum，从而清楚地描绘了所观察到的M1和M2形态的细菌。结果发现C.innocuum激发的最小M1反应显著低于LPS阳性对照，且与未激发的或IL-4阴性对照没有差异 (图7B)，而CD群在所有处理组中诱导了最高的IL1β和TNFα反应。M2标记物分析表明，炎症反应的M2巨噬细胞M2B可被LPS和CD联合刺激，但不受C.innocuum分离株的刺激。然而，C.innocuum显著增加CD206的表达，但不增加CD163的表达，提示C.innocuum可能选择性地促进促纤维化的巨噬细胞M2a的表达。这些数据表明，C.innocuum易位可能不是巨噬细胞中引发明显的促炎反应的原因。这可能是由于其逃避这些细胞的能力，这一点在所有的CrF C.innocuum菌株中由精氨酸酶的保守基因所证明的。，CD MAT中存在的C.innocuum可能促进M2表型，从而重塑脂肪环境。为了验证这一假设，作者从CD MAT中分离出原代成纤维细胞和脂肪来源的干细胞，将这些细胞直接暴露于C.innocuum裂解物或暴露于C.innocuum暴露的巨噬细胞条件培养液中。通过检测Ⅰ型胶原(COL1A1)、Ⅳ型胶原(COL6A3)和透明质酸合成酶1(HAS1)的基因表达发现，单纯的C.innocuum裂解物不足以调节这些基因中的任何一个；然而，巨噬细胞共培养的裂解物显著增加了COL1A1的表达(p<0.001)，并有增加HAS1表达的趋势(图7C)。有限的标记物不能最终确定哪种祖细胞类型与我们观察到的脂肪纤维化直接相关；然而，它确实告诉我们，C.innocuum需要一种免疫细胞介质来诱导其促纤维化作用。 图7 C.innocuum在体外促进M2巨噬细胞极化和创面修复反应(A)PBMC来源的巨噬细胞单独暴露于LPS、IL-4、C.innocuum裂解物和包括C.innocuum在内的Cd相关生物联合体的裂解物24小时后的代表性图像。(A)PBMC来源的巨噬细胞单独暴露于LPS、IL-4、C.innocuum裂解物和包括C.innocuum在内的镉相关生物的裂解物后的代表性图像。(B)免疫原性测定，测定PBMC来源的巨噬细胞在暴露于来源于CrF或CD MAT的CD-CrFB和CD-Mat C菌株(见图3D)或不含CD菌的CD伴生生物联合体时的极化情况。(B)测定PBMC来源的巨噬细胞在暴露于来源于CrF或CD MAT的CD-CrF B和CD-MATC菌株时的极化。(C)将CrF来源的祖细胞与C.innocuum裂解物直接共培养，或与暴露于(B) C.innocuum裂解物的巨噬细胞的条件培养液共培养。QRT-PCR检测基因表达。单因素方差分析采用图基多重比较检验(D)；*p<0.001，**p<0.0001。 讨论 这项研究的主旨是CD中一种独特的肠外现象，其发现为脂肪组织在人体中的作用以及肠道微生物群如何影响脂肪行为提供了新的见解。脂肪作为多余卡路里的储存形式的作用虽然是必要的，但也暗示了它在身体中的起被动作用。然而，该项研究指出，脂肪可塑性可能还有另一个重要的目的，就是保护身体免受炎症或损伤部位有害抗原的扩散，且假设这是CD患者发生CrF的主要驱动因素。 本研究发现，在健康组织中细菌从肠道到MAT的移位在一定程度上自然发生，且没有严重的后果，如免疫细胞的涌入，也没有激活的Phe亚型。但在慢性肠道炎症状态下，例如在CD中，肠道微生物被永久扰乱，在这种情况下，细菌易位发生的程度会更高，而且与健康状态下看到的微生物位移不同。鉴于脂肪不仅由脂肪细胞组成，还有丰富的天然和获得性免疫细胞、内皮细胞和祖细胞组成的群落，因此某些细菌在该组织中的存在必然会引起细胞反应。 该文确定了一种微生物机制来解释慢性肾功能衰竭在CD中的扩张，这种机制是由肠道来源的细菌C.inocuum驱动的，这种细菌发生移位并在MAT中存活。在IBD中，其移位并保持存活的能力是CD患者独有的，并表现出一种区分粘膜和脂肪的遗传菌株变异，以及区分CrF和MAT的进一步功能变异。该菌的核心基因组特征包括IV型菌毛和抽搐运动，对脂类代谢底物的偏好，多个脂质分解代谢基因以及对脂肪酸氧化副产物b-羟基丁酸酯的底物偏好。这表明C.inocuum非常适合，也更偏好富含脂质的环境。与粘膜分离株相比，脂肪分离株的不同特征包括先天免疫细胞逃避杀伤的基因。这突出了在微生物组研究中需要考虑菌株变异的重要性，特别是即使是遗传上相同的菌株也可能因组织来源的不同而表现不同。 C.inocuum定植的CrF组织的T和B细胞群几乎不存在于H MAT中，而邻近未受累的CD MAT则同时表现出H MAT和CD CrF的细胞特征，提示CD MAT可能代表了健康和CRF之间的中间过渡阶段。我们还发现，虽然CrF是一种视觉上截然不同的脂肪扩张状态，但ECM相关基因、微生物感知和杀伤相关的基因在转录组中表达最高。scRNA-seq鉴定的M1/M2混合巨噬细胞群具有一定意义，它是本研究中所有组织中占主导地位的先天免疫细胞类型。因此，如果细菌移位到了一定程度，巨噬细胞很可能是它们沟通的主要细胞。CrF的特点是纤维化表达增加，而M2亚型参与促进纤维化和组织修复，C.inocuum不能引起M1极化，但能显著增加CD206+M2巨噬细胞的表达，提示C.inocuum可能直接与促纤维化创面愈合的M(2a)亚型相互作用。其他CD特异性细菌的联合确实引起M1极化，这可能解释了巨噬细胞表型的异质性。 作者还提出一些值得探讨的有趣的问题。例如，淋巴液体淤积的一种慢性状态-淋巴水肿已被证明也会导致淋巴管周围的成脂和纤维化脂肪扩张，以响应损伤或细菌抗原。鉴于肠系膜淋巴结通常嵌在整个膜上，在该研究中，它被从样本中移除，很可能在慢性肾功能衰竭的发生中起作用，当然这这需要进一步研究。本研究并不能得出单独的C.inocuum导致MAT扩张，情况也确实是不这样的。很可能是存在临界量的微生物负载，至少在CD的背景下，C. innocuum是最丰富的。 尽管如此，本研究的数据有助于阐明一个长期存在的问题，即人类CD中的CrF是有害的还是有益的，很可能两者兼而有之。最初是对肠道损伤和细菌传播的反应，有助于人体的保护性反应，并限制系统抗原暴露的附带损害，但在持续的微生物暴露中，似乎没有关闭开关。这种伤口愈合反应反过来会导致肠系膜脂肪显著纤维化，在切除回肠时，回肠也明显纤维化。这可能会保护身体免受全身性炎症，试图将炎症保持在局部；然而，未加缓解的扩张会对底层组织造成严重后果，包括CrF侵入肠壁。因此，减缓高危患者的肠道储存库的治疗策略可能为预防或减轻纤维化提供一条途径。“。
|
|
|
