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编译：YQ，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 土壤是地球上第二大碳库，约2000Pg以土壤有机碳（SOC）形式存在。土壤有机碳为微生物生长提供重要的碳来源和营养供应，维持土壤健康。土壤有机碳调节CO2的固定和释放，有助于调节短期气候，减缓气候变化。土壤有机碳来源于植物碎屑和微生物。在控制土壤有机碳方面，异养微生物有两个关键角色：分解产生二氧化碳促进碳向大气的释放；通过代谢将不稳定的有机碳转化为更稳定的形式。而自养微生物固定大气中的CO2，并将其合成微生物生物量（MBC），直接形成有机碳库。自养代谢导致碳固定，并在细胞增殖、种群增长和死亡的连续迭代过程中增加土壤有机碳。然而自养碳固定在土壤有机碳形成的作用有待研究。 二氧化碳同化为有机物质是地球上重要的生物合成过程，自然界包括6种碳固定通路：卡尔文循环、还原三羧酸循环、还原乙酰辅酶a途径、3-羟基丙酸循环、3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环、二羧酸根阴离子/4-羟基丁酸循环。催化某一特定途径的酶通常是保守的，并作为关键酶，相应的编码基因通常被称为标记基因，用于微生物生态学研究。例如，cbbL（核糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）用于标记卡尔文循环，acl（ATP柠檬酸裂解酶）和oorA（酮戊二酸）用于标记还原三羧酸循环的受体氧化还原酶，hcd（4-羟基丁酸酰基-辅酶A脱水酶）标记4-羟基丁酸循环。 水稻土是常见的土壤类型，是研究土壤微生物生物化学过程的理想模式系统。本研究采用宏基因组学和14C标记方法确定水稻土中多种自养代谢吸收和碳固定潜力。确定水稻土中微生物碳固的关键因素，包括土壤理化性质。本研究为自养碳固定在有机碳形成中的作用机制提供新见解。 论文ID 实验设计 ①土壤样品及DNA提取。本研究选取中国南方5个地区的表层土（0-20cm）：广东雷州（LZ）、浙江嘉兴（JX）、江西鹰潭（YT）、湖南固始（TY-G）、湖南宝东峪（TY-B）。从5个水稻土壤中提取DNA，共10份DNA样品。 ②宏基因组测序。在Illumina TruSeq平台建库测序，10个样品平均75038500 reads。为加快注释速度，抽取5个碳固定通路标记基因（cbbL、aclA、acsA、accA、hcd）的KEGG通路进行序列注释。BLASTX将每个reads与数据库比对，每个基因的相对丰度以比对数/总读数（ppm）为准。Shannon-Weiner多样性指数（H）量化微生物群落多样性，基于Spearman相关性计算微生物共现网络。 ③14C示踪法。每个地区取500g新鲜土壤，在14C-CO2标记下连续孵育45d。孵育结束后分成两部分：一部分70℃烘干确定碳固定量；另一部分4℃保存确定微生物生物量。采用湿筛法对土壤粒度进行分选，70℃干燥，NaOH-Na4P2O7·10H2O作为提取剂从干燥土壤提取有机碳，自动液体闪烁计数器测定14C放射性，熏蒸-萃取法测定14C微生物生物量。 结果 1、水稻土壤不同自养途径的标记基因 在所有样本中检测到六种自养途径的标记基因（图1）：cbbL（卡尔文循环，编码二磷酸核酮糖羧化酶）7.2-11.7ppm，aclA（还原三羧酸循环，编码ATP柠檬酸裂解酶）0.8-1.6ppm，acsA（还原乙酰辅酶a途径，编码一氧化碳脱氢酶）0.7-1.9ppm，accA（3-羟基丙酸循环，乙酰辅酶a羧基转移酶亚基）0.02-0.1ppm，hcd（4-羟基丁酸循环，编码4-羟基丁基辅酶a脱水酶）0.2-1.8ppm。在所有样本中cbbL基因占主导地位，而accA基因最低。 2、水稻土壤的自养微生物 基于六种自养途径的标记基因，发现cbbL微生物多样性最高，acsA次之，hcd和accA次之，aclA多样性最低。在卡尔文循环中，共80个相关属，其中34种光能营养型，50种化能营养型，3种混合养型（沼泽红假单胞菌、紫假硫囊藻、类球红细菌）。在还原柠檬酸循环中，这些微生物均为化能营养型，以脱氟硝螺为主。在还原乙酰辅酶a途径中，28个属均为化能营养型，主要为硫酸盐还原细菌、产乙酸菌、产甲烷菌。参与3-羟基丙酸循环的4个属均为光能营养型（绿曲挠丝状菌、海洋绿滑菌、海滨赤杆菌、玫瑰弯菌RS-1）。在4-羟基丁酸循环中，所有检测到的属都属于化能营养的古菌，主要为氨氧化古菌。自养微生物共现模式如图2所示，卡尔文循环和还原性乙酰辅酶a途径相关微生物在网络中占主导地位，同一途径相关的微生物共现性更强。 图2 基于相关性分析的水稻土壤自养微生物共现网络。节点大小表明连接数，颜色表不同途径。边的宽度表相关性，颜色表正（粉）/负（蓝）相关。 3、14C-CO2追踪 14C-CO2孵育45d后测定土壤有机碳和微生物生物量的14C含量。结果表明从14C环境下培养的土壤中可以回收大量的14C-SOC（土壤有机碳）和14C-MBC（微生物生物量）（图3a）。14C-SOC和14C-MBC的含量分别为74.3- 175.8 mg/kg和5.2-24.1mg/kg，不同土壤间有机碳和基质碳的掺入量差异较大。土壤中二氧化碳同化成有机碳的速率为34.2-62.2 mg C m-2 d-1（图3b）。土中总铁、粘粒、砂含量和cbbL丰度与14C-SOC含量显著相关。 孵育45d后，水稻土14C-SOC在土壤中的分布表现为物理分选和化学分选。14C-SOC主要存在于微团聚体颗粒（0.25-0.053 mm）、粉土、粘土（图4a）。至于化学组分，14C-SOC富集于腐殖质（HM）和黄腐酸（FA）（图4b）。 图3 5种水稻土中14C-SOC、14C-MBC含量和14C-SOC合成速率。 图4 14C-SOC在不同团聚体粒径和不同化学组分中的分布。 讨论 本研究首次采用宏基因组分析和14C示踪法系统地检测和比较了六种自养途径的微生物的碳固定。结果表明卡尔文循环是稻田最丰富的途径，而其它研究表明沙漠土壤中还原柠檬酸循环占主导地位，深海热液区以还原三羧酸循环为主。这表明不同自养代谢产物具有生态位偏好。携带cbbL标记基因的微生物以蓝藻细菌为主，化学自养生物以硫、氨和铁氧化的微生物为主。在水稻土中，自养微生物是活跃的，将CO2吸收到生物量中，对土壤有机碳有重要贡献。本研究中土壤只有在光照下才检测到显著的14C同化作用，而在黑暗中几乎没有吸收，这表明水稻土壤中微生物的CO2同化过程主要是由自养生物（包括光合和化学自养微生物）驱动。孵育45d后，以14C标记SOC为0.4-1.4%，MBC为6.7-15.1%，假设水稻土进行净自养代谢，SOC周转时间为8.8-30.3年，MBC为0.8-1.8年。这说明微生物固定CO2可以维持水稻土微生物生物量相对较快的周转，但分解成有机碳后趋于稳定。超过70%的14C-SOC富集于腐殖质中，这些腐殖质最不容易被微生物降解，它们通常与土壤矿物质密切相关。水稻土中粘粒含量、总铁和14C-SOC之间存在显著的正相关关系，这属于控制有机碳持久性的一种非生物机制，其中粘土和铁氧化物是主要的矿物。土壤微生物可分泌胞外聚合物（EPS），与土壤矿物质的结合中发挥重要作用，形成稳定的土壤团聚体，帮助稳定土壤有机碳。本研究中14C-SOC分布在不同粒径的土壤团聚体中，说明自养型碳固定的有机碳对土壤团聚体的形成有贡献。此外，自养生物合成的有机碳可以被异养微生物甚至病毒处理后转化为MBC或SOC。因此，矿物质保护、聚集、微生物转化等多个过程可以增强水稻土自养代谢对有机碳的积累。 水稻土存在多种自养代谢产物，是研究自养代谢产物的重要材料。水稻土中存在周期性变化的氧化还原条件，这是研究氧对自养途径进化和多样化作用的理想环境。由于历史上的氧化作用事件，自养途径出现多样化，许多自养途径的关键酶对氧的敏感性不同，直接决定了它们在不同环境中分布。有些微生物不止一种自养途径，如具有卡尔文循环和rTCA途径基因的硫黄菌，使用不同的固定途径对这种细菌共生体是有利的，也有助于水稻土的高效固碳。综上所述，在所有水稻样品中使用宏基因组分析检测到六种自养途径的标记基因，其中以卡尔文循环中的cbbL基因为主。自养微生物具有活性，在45d孵育后，可将74.3-175.8mg C kg-1吸收入土壤，将5.2-24.1mg C kg-1吸收入生物量。自养微生物是稳定有机碳库的重要组成部分，70%以上的有机碳集中在腐殖质组分中。本研究强调了微生物固定二氧化碳对水稻土壤有机碳积累的重要性。
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