 编译：小仙女，编辑：小菌菌、江舜尧。 环境梯度对群落构建过程有很大影响。为了揭示碱性尾矿废水对细菌和反硝化细菌群落组成和多样性的影响，作者在中条山十八河铜尾矿废水形成的生态梯度下分析了细菌优势类群相对丰度和反硝化功能基因（nirS，nirK和nosZI）丰度的变化，以及不同生境中细菌和反硝化细菌群落组成的差异及其与环境变化的关系。 结果表明，细菌群落的丰富度和多样性沿水流方向逐渐增加，这种变化与电导率（EC），硝态氮（NO3-），亚硝态氮（NO2-），总碳（TC），无机碳（IC）和硫酸盐（SO42-）含量显著相关，但不受空间距离变化的影响。从纲到属优势类群相对丰度的变化都与NO3-和NO2-相关。优势类群红杆菌属（Rhodobacter）, 不动杆菌属（Acinetobacter）和嗜氢菌属（Hydrogenophaga）均是典型的反硝化细菌。这些优势反硝化菌相对丰度的变化趋势与反硝化功能基因（nirS，nirK和nosZI）的拷贝数一致，表明这些细菌在氮还原过程中的重要性。nirK和nosZI的丰度以及nirS和nirK的相对丰度与NO3-，NO2-和IC密切相关，三个反硝化功能基因（nirS，nirK和nosZI）的拷贝数与重金属铅和锌负相关，表明，重金属污染也是影响反硝化细菌群落结构的重要因素。该研究确定了在碱性尾矿废水中细菌群落沿理化梯度的分布模式，并揭示了影响细菌群落结构的驱动力。NO3-，NO2-，IC和重金属对细菌群落的影响主要体现在对参与碳，氮和金属代谢功能类群的影响上。 论文ID原名：Ecological patterns and adaptability of bacterial communities in alkaline copper mine drainage译名：碱性铜尾矿废水中细菌群落的生态模式和适应性期刊：Water ResearchIF：9.13发表时间：2018.01通讯作者：柴宝峰通讯作者单位：山西大学黄土高原研究所 实验设计 在中条山十八河铜尾矿库沿废水流动的方向从上游到下游设置了3个采样点（STW1、STW2、STW3）采集库内水，同时在上游和下游尾矿坝外各设置一个采样点（SDSW和SUSW）采集渗流水（图 1）。利用自动水样采集器（W2BC-9600）收集水样，取样深度距表层1 m。每个样品取水2 L，每个采样点取3个重复，样品采集于2016年9月。水样在原地通过0.2 μm的微孔滤膜（Millipore, 津腾, 天津）过滤1.5 L用于收集水体微生物，后将滤膜置于便携式液氮罐中，剩余的0.5 L带回实验室用于理化参数的分析，在一个月内完成测试。提取微生物的DNA后，扩增细菌16S rDNA的V3-V4高变区，后在Illumina MiSeq平台上进行高通量测序；同时通过荧光定量扩增了细菌的16S rDNA V3区和3个反硝化功能基因（nirS，nirK 和nosZI）获得每个采样点细菌和反硝化细菌的丰度。水体pH、溶解氧（DO）、电导率（EC）、硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+）含量通过便携式水质检测仪（Aquread AP-2000, UK）原位测定；总碳（TC）、总有机碳（TOC）和无机碳（IC）含量用TOC分析仪（Shimadzu, TOC-VCPH, Japan）测定；亚硝态氮（NO2-）和硫酸盐（SO42-）含量用全自动间断化学分析仪（DeChem-Tech, CleverChem380, Germany）测定；所有重金属含量（As、Cd、Cu、Pb、Zn）用ICP-AES （iCAP 6000, hermo Fisher, UK）测定。用SPSS分析水体理化参数、细菌和反硝化功能基因的拷贝数以及反硝化功能基因拷贝数与细菌拷贝数的比例在不同采样点的差异。用R和Canoco分析了细菌群落结构变化及其影响因素。  图1 十八河尾矿库采样点的位置，箭头表示尾矿水的流动方向。 结果 1 尾矿废水中的理化性质 采样位置沿水流方向设置从而形成了一定的污染梯度。pH、NO3-和NO2-含量在STW1中最大，且显著高于STW3、SDSW和SUSW（表1）。pH、EC、NO3-、NO2- 和SO42-沿着水流方向形成明显的梯度STW1>STW2>STW3，由于尾矿坝是用尾矿砂堆积而成，因此尾矿坝体就像一个过滤柱，尾矿水在渗流的过程中水中含有的部分重金属和其它污染物被过滤掉，因此2个渗流水SUSW和SDSW中pH、EC、NO3-、NO2-和SO42-的含量低于库内水（STW）。DO、TC、TOC和IC在STW3最大，表现为沿水流方向增加的趋势（STW1<stw2<stw3），且ec、so42-、nh4+、tc和toc含量与渗流水显著不同。5个重金属只有cd和zn沿水流方向逐渐增加，但是在不同采样点的差异不显著（表1）。< p=""> 2 细菌群落结构与分类鉴定 根据97%的相似性5个样地的OTU个数分别是：370、687、905、685和1010（表2）。5个样地的Shannon指数分别是：3.16、5.79、5.65、5.39和 6.37，表明相对于STW1来说在SUVW, STW2, STW3和SDVW中细菌的多样性较大；OTUs、ACE、Chao1和Simpson指数也是STW1最小，细菌群落的丰富度表现为沿水流方向逐渐增加的趋势（表2）。  表2 采样点细菌群落的丰富度和多样性估计 基于Bray-Curtis距离的PCoA排序结果表明不同采样点的群落结构存在差异，5个采样点可以分为3组：STW1、STW2和SUSW以及STW3和SDSW（图2）。细菌群落的空间分布格局与水体理化参数具有一致性，均表现为沿水流方向变化的趋势。  图2 基于Bray-Curtis距离的细菌群落相似性的主坐标分析 所有样品中OTU序列分别隶属于26个不同的门（图3）。优势细菌门（相对丰度>1%）包括变形菌门（Proteobacteria）（相对丰度41.20-89.49%），放线菌门（Actinobacteria）（0.41-24.44%），[Thermi]（2.30-22.81%），厚壁菌门（Firmicutes）（3.79-13.99%），拟杆菌门（Bacteroidetes）（2.50-7.72%），蓝藻（Cyanobacteria）（0.11-4.70%），绿弯菌门（Chloroflexi）（0.004-1.51%），疣微菌门（Verrucomicrobia）（0.01-2.19%）和OD1（0.007-1.30%），其中7个优势门的相对丰度与环境参数显著相关（表3.4）。α-变形菌纲（21.44-76.15%），β-变形菌纲（2.49-12.31%）和γ-变形菌纲（1.03-38.81%）在5个样地中均存在，但是δ-变形菌纲（0.005-0.35%）只在4个样地存在，在STW1样地没有，表明5个样地中细菌群落的组成存在差异。  图3 不同采样点细菌群落在门水平的组成 未鉴定到属的序列占到31.80-66.70%，样地STW1中优势属是unidentified- Rhodobacteraceae，其相对丰度沿着水流方向逐渐降低。在STW2和SUSW中相对丰度最大的属是异常球菌属（Deinococcus），在STW3中是不动杆菌属（Acinetobacter），在SDSW中是分枝杆菌属（Mycobacterium）。 16S rDNA的拷贝数变化可代表细菌群落丰度的变化，细菌拷贝数从上游（STW1）6.90×105± 5.45×104到下游渗流水（SDSW）5.14× 106± 3.40×105逐渐增多，且差异显著（P< 0.01）（图4）。细菌丰度的变化与DO、TC、TOC和IC浓度显著正相关，与EC、NO3-、NO2-、NH4+、SO42-、As和Pb浓度显著负相关。  图4 5个采样点中细菌16S rDNA拷贝数的分布模式 3 核心类群的空间格局 分别在纲、目、科和属水平上相对丰度>1%的前10个优势类群定义为核心类群。前10个优势纲的相对丰度占整个群落的90.6-97.9%（图5a），前10个优势目的相对丰度占整个群落的82.2-92.0%（图5b），前10个优势科的相对丰度占整个群落的62.1-86.7%（图5c），前10个优势属的相对丰度占整个群落的27.3-56.4%（图5d）。在5个样地中核心类群的相对丰度明显不同。Alpha-变形菌纲和所属类群：红杆菌目（Rhodobacterales）、红杆菌科（Rhodobacteraceae）和红杆菌属（Rhodobacter）以及Beta-变形菌纲和所属类群：伯克氏菌目（Burkholderiales）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）和噬氢菌属（Hydrogenophaga）的相对丰度沿水流方向逐渐减少。然而，Gamma-变形菌纲以及所属类群：假单胞菌目（Pseudomonadales）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、不动杆菌属（Acinetobacter）和军团菌属（Legionella）；放线菌门以及所属类群：放线菌目（Actinomycetales）、分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）和分枝杆菌属（Mycobacterium）；集球藻目（Synechococcophycideae）以及所属的集球藻属（Synechococcus）；Acidimicrobiia；柄杆菌目（Caulobacterales）以及所属的柄杆菌科（Caulobacteraceae）和根瘤菌目（Rhizobiales）以及所属的叶瘤菌科（Phyllobacteriaceae）的相对丰度沿水流方向逐渐增加（图5）。异常球菌纲以及所属类群：异常球菌目（Deinococcales）、异常球菌科（Deinococcaceae）和异常球菌属（Deinococcus）；芽孢杆菌纲（Bacilli）以及所属类群：芽孢杆菌目（Bacillales）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）和芽孢杆菌属（Bacillus）；黄杆菌纲（Flavobacteriia）以及所属的黄杆菌目（Flavobacteriales）；鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）以及所属的鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）和新鞘脂菌属（Novosphingobium）；鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia），微杆菌科（Microbacteriaceae）以及Candidatus Aquiluna属的相对丰度在样地STW2中最大。核心类群的相对丰度在渗流水SUSW中和SDSW也存在显著的差异（图5）。  图5 不同采样点细菌群落的的核心类群。a) 纲水平；b) 目水平；c) 科水平；d) 属水平 4 细菌群落组成与环境参数的相关性 Mantel检验表明整个细菌群落组成与理化参数（EC、NO3-、NO2-、TC和SO42-）显著相关；同样优势细菌群落（abundant OTUs）的组成与EC、NO3-、NO2-和IC显著相关（表3）。但是pH、DO、重金属（As、Cd、Cu、Pb、Zn）和地理距离与整个细菌群落以及优势细菌群落均没有显著的相关性（表3）。 RDA分析结果表明环境参数对核心类群在纲（F=2.4，P< 0.05）、目（F=2.6，P< 0.05）、科（F=2.5, P< 0.05）和属水平（F=7.1，P< 0.05）均有显著的影响。在纲、目、科和属的水平主要受到NO3-、NO2-、SO42-和pH的影响（表S8），多元相关性分析结果也表明NO3-、NO2-、TC、IC、SO42-和重金属（As、Cu、Pb、Zn）对几个核心类群有显著的影响（表S3-S7）。  表3 细菌群落结构与环境参数的Mantel检验结果 5nirS, nirK和nosZI基因拷贝数沿水流方向的变化趋势 在本研究中扩增的反硝化功能基因包括参与2个关键反硝化过程的3个基因分别是：编码亚硝酸盐还原酶的（nirS和nirK）基因以及编码一氧化二氮还原酶的（nosZI）基因。在5个取样点每毫升水中nirS的拷贝数是2.12×103 -3.23 ×104，nirK是4.73×100-3.84 ×104，nosZI是4.14 ×104-2.33 × 105（图6）。在STW3和STW2中nirS的拷贝数显著高于STW1，但是nirK的拷贝数在3个库水中差异不显著，nosZI的拷贝数在STW2中最大，且显著高于STW1和STW3。渗流水中的3个反硝化功能基因的拷贝数均是SDSW显著高于SUSW（图6）。  图6 不同采样点nirS, nirK和nosZI的拷贝数 在5个采样点，3个反硝化功能基因的相对丰度nirS/16S rDNA，nirK/16S rDNA和nosZI/16S分别是0.12-1.46%，2.58-1.38% 和1.81-6.03%，它们的相对丰度沿水流方向逐渐减小（图7），在渗流水中3个反硝化基因的相对丰度均没有显著的变化。在库水中NirS/16S rDNA和nirK/16S rDNA分别是渗流水的3.71和3.49×103倍，但是在渗流水中nosZI/16S rDNA是库水的1.22倍。  图7 不同采样点中nirS，nirK和nosZI相对丰度的变化趋势 6 环境参数对nirS，nirK和nosZI基因拷贝数的影响 NosZI与nirS和nirK对环境变化的响应策略不同。nirS和nirK的相对丰度与pH、NO3-和NO2-浓度正相关，与IC和Zn的浓度显著负相关，但是nosZI 与nirS和nirK的趋势相反（表4）。nirS、nirK和nosZI 的丰度与Cu离子浓度正相关，与Pb离子的浓度负相关（表4）。3个反硝化功能基因的相对丰度与取样位置存在显著的相关性，从上游到下游逐渐减小（图 8），这种变化趋势主要受到水体理化参数（NO3-、NO2-、IC、pH和Zn）变化的影响（表4）。  表4 16S rDNA、nirS、nirK、nosZI的拷贝数以及3个反硝化功能基因的相对丰度与环境参数的相关性分析 图8 反硝化功能基因的相对丰度与采样位置的相关性分析 讨论 1 AlkMD中的细菌群落 微生物群落的组成和分布与其生境的生物和非生物因素紧密相关，这为我们更好理解微生物在生态系统中的功能提供重要线索。一些研究表明微生物群落对局域环境变化敏感，这与我们的研究结果一致。本研究表明细菌群落的多样性沿水流方向变化明显（表2，图2，图4），这种变化趋势主要与NO3-、NO2-、SO42-和TC浓度相关（表3，表4）。有限的证据表明，这种多样性模式主要是通过物种分选过程（即根据当地环境条件进行选择）来构建的。这样的细菌群落组成模式是对环境条件适应的表现，例如对能量（硝酸盐、硫酸盐和碳）的有效性作出反应；相反，细菌丰富度的变化可能是由于影响细胞过程和信号传导的应激反应造成的。当环境发生剧烈变化时，如尾矿废水的排放，适应该环境的微生物类群就会大量繁殖，否则就会灭绝。这种环境梯度可以明显改变群落组成，在较低污染区域微生物群落的丰富度增加，在中等污染区域微生物群落的多样性增加。As和Pb的浓度对细菌群落有明显的抑制作用（表4），因为重金属毒性会使微生物群落的碳、氮、硫代谢能力降低甚至丧失，因此高浓度的重金属会降低细菌群落的丰度。重金属对细菌的毒害通常是由于造成了酶的失活、细胞膜损伤、与核酸结合、养分运输的变化以及底物的可用性改变等，由于金属与酶蛋白、膜蛋白和核酸酶结合，从而改变其结构，最终导致细胞活性的丧失。在酸性尾矿废水中（AMD）pH对微生物群落的多样性、丰富度和功能基因丰度存在显著的影响。本研究中虽然库水和渗流水中的pH存在显著的梯度（表1），但是并不是影响细菌群落组成和多样性变化的主要因素（表3，表4）。这与Bier对阿尔卑斯山脉AlkMD中微生物群落的研究结果一致，可能是由于pH变化范围太小（8.01-9.38）而在AMD中一般变化范围不低于4。这也表明在本研究区域细菌群落的多样性变化主要是EC、NO3-、NO2-、SO42-和重金属含量变化引起的，而不是pH。地理距离也是造成细菌群落多样性格局变化的重要因素，但是在本研究区地理距离与细菌群落结构没有显著的相关性（表3），表明是环境选择驱动了细菌群落的多样性格局。q-PCR得到的细菌拷贝数（图4）大于高通量测序结果（表2），主要是由于2个实验所用的扩增引物不同；另一方面，q-PCR反应中16S rDNA的扩增效率是101.1%，这也是造成细菌丰度偏高的一个重要原因。 细菌群落对环境的适应是功能的适应。变形菌门是5个取样点中丰度最高的门（图3），这与前人对AlkMD中细菌群落的研究结果一致，说明变形菌门在尾矿废水净化过程中的核心作用。变形菌门的相对丰度沿水流方向从STW1到SDSW逐渐减少是由于NO3-和NO2-浓度的变化（表4）引起隶属于变形菌门的典型反硝化类群红杆菌科、嗜氢菌属和红杆菌属的改变（表S1）。放线菌门相对丰度的变化趋势与变形菌门相反，沿着水流方向从STW1到SDSW逐渐增加（图3），这中变化趋势主要受SO42- 和TOC浓度变化的影响（表S2）。Hou[等对土壤细菌群落研究发现EC与放线菌门的相对丰度正相关，而与TC含量负相关，该结果与本文研究结果相反，可能是由于不同的研究区域和研究对象造成的。厚壁菌、拟杆菌和[Thermi]的相对丰度在STW2和SUSW中较高，这与中度污染假说一致，表明这三个类群具有相似的生态位。蓝藻和绿弯菌是水体中常见的自养微生物，它们的相对丰度沿水流方向逐渐增加（图2），主要是由于NH4+、NO2-、NO3-和TC含量的变化（表S2）驱动了这两类细菌类群的分布格局。蓝藻通过释放胞外酶来缓冲环境压力从而可以适应AlkMD的污染环境。疣微菌门可在多种生境中生长如土壤、底泥以及一些极端的生境如热泉、极酸或碱性水体中。疣微菌门的相对丰度沿水流方向逐渐增加（图3），主要由Pb和TOC浓度的变化引起。OD1类群在氢和硫的循环过程中发挥重要的作用，然而在AlkMD中是否与硫的循环有关，还需进一步研究。 2 核心类群组成及其生态功能 优势细菌类群在生态系统中发挥关键作用，因此优势菌群的动态可以间接地反映整个细菌群落对环境变化的适应过程。在5个取样点核心类群从纲到属水平均有明显的变化，但是在属水平的核心类群在不同采样点均有分布（图5，表S1），表明AlkMD的环境条件具有相似的背景，各采样点的特定条件对微生物群落组成的影响要次之。STW1中主要的核心类群是红杆菌属和嗜氢菌属；STW3中主要的核心类群是不动杆菌属；SUSW中主要的核心类群是异常球菌属；SDSW中的核心类群是分枝杆菌属（图5c，图5d），表明不同取样点微生物类群所行使的生态功能不同，因此环境选择是通过改变关键类群的组成和结构来影响整个群落的。 不同分类水平的核心群落具有相似的适应机制，这种适应性与NO3-、NO2-、TC和IC 浓度变化相关。主要的水生优势类群红杆菌科和嗜碱性类群红杆菌属都是典型的厌氧光合紫色非硫细菌，这些细菌在呼吸过程中用NO3-和NO2-作电子受体。嗜氢菌属是污染生境中的常见类群，它们通过反硝化作用获得能量，因此硝酸盐浓度是影响群落结构变化的重要因素。叶杆菌科（Phyllobacteriaceae）对环境有较好的适应性，这类细菌除了具有反硝化作用外，还可能在碳循环中发挥重要作用。分枝杆菌属在多种生境中均有分布，其主要的生态功能是参与碳的降解。在污染生境中，黄杆菌属和新鞘脂菌属也是常见的微生物类群，它们通过释放胞外聚合物来降低重金属毒性。军团杆菌属的相对丰度在SUSW中最大（图5），大多数军团杆菌属细菌是水生菌，它们被认为具有兼性致病性。Wullings等对饮用水中的军团杆菌属细菌研究发现，其多样性主要受可溶性有机碳浓度的影响，但是在AlkMD是否也与可溶性有机碳相关目前还未见相关的报道。 3 反硝化基因拷贝数的变化与能量的可利用性 硝酸盐浓度是影响反硝化功能基因丰度变化的重要因素，如之前对Colne河口，湖泊和地下水的研究均表明硝酸盐浓度对反硝化细菌群落结构存在显著影响，说明能量的可用性直接影响细菌的细胞代谢。反硝化作用是由反硝化微生物驱动的，在氮的生物地球化学循环中起着至关重要的作用。研究结果表明，反硝化细菌的丰度和相对丰度因环境变化而变化（表4，图8）。 反硝化功能基因nirS的丰度从STW1到SDSW逐渐增加（图6），这种变化趋势主要是由于Pb和Zn的抑制作用越来越小（表4），这也说明反硝化细菌对重金属污染比较敏感。nirK和nosZΙ的拷贝数与NO3-和NO2-浓度变化显著相关，但是二者的变化趋势相反（表4），表明这两个类群的生态适应策略不同。3个反硝化功能基因的相对位置与营养状况（采样位置）显著相关（表4，图8），该结果与已有的研究结果一致，NO3-和NO2- 浓度减小反硝化细菌的丰度也会降低。本研究中nirS+nirK/nosZΙ大于1:1，表明参与N2O还原的反硝化细菌数量较多，因此可以推断出在反硝化过程中没有温室气体（N2O）的排放。 同时，我们还发现SUSW中的nirS和nirK不论是丰度还是相对丰度在5个样地中均最小，这很可能是由于在SUSW中Zn的浓度太高而Cu的浓度偏低。Cu和Fe的生物可利用性影响亚硝酸盐和氧化亚氮还原酶的表达和活性，因为nirS基因编码含铁的cd1-type还原酶，nirK基因编码含铜还原酶，所以Cu和Fe含量会影响nirS和nirK的表达。遗憾的是在本研究中没有测定Fe的含量，因此我们只能推测Fe的含量可能是影响因素。nosZΙ基因的丰度和相对丰度的变化趋势与nirS和nirK不同，其丰度在STW1中最小（图6），但是相对丰度在STW1中却最大（图7）。nosZΙ的拷贝数和相对丰度的格局与不动杆菌属类群的组成相似（图5d），不动杆菌属细菌是重要的含有nosZ基因的反硝化细菌。不动杆菌属细菌对环境有较强的适应性，可参与氮代谢且对重金属有耐受性。 |
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