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编译：李子苹果桃，编辑：木木夕、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 由真菌病原体引起的植物病害对全球食品和水果行业造成了巨大的经济影响。施用辅以生物防治微生物的有机肥(即生物有机肥)能提高对植物病原体的抗性，部分原因是对原生土壤微生物组的结构和功能产生影响。然而，尚不清楚这种改善是否是由微生物接种剂的特殊作用、天然存在于有机肥料中的微生物种群还是堆肥基质的物理化学性质所驱动的。本研究的目的是寻求生物有机肥抑病活性的生态机制。为了弄清生物有机肥的作用机理，我们设计了用以下四种处理方法追踪香蕉枯萎病和三个生长季节土壤微生物群落变化的实验：含枯草芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）W19的生物有机肥（OF+W19）、有机肥（OF）、灭菌有机肥（SOF）和接种枯草芽孢杆菌W19的灭菌生物有机肥（SOF+W19）。我们发现，将芽孢杆菌重新接种的灭菌生物有机肥在各种生长季节对病害的抑制程度与非灭菌生物有机肥相似。我们进一步观察到，这些处理中的病害抑制与原生土壤微生物群落的影响有关，特别是通过导致特定的假单胞菌属（Pseudomonas）的增加。在实验室盆栽实验中，进一步研究了芽孢杆菌和原生土壤假单胞菌之间的相关性，这可能是抑制病原体的基础。这些研究揭示了特定的细菌类群协同促进生物膜的形成，并形成有利于植物的联合体以此对抗病原体。总之，我们证明了生物有机肥是有机改良剂中的生防接种物及其对土壤微生物群落的影响的产物。这些知识应有助于设计更高效的生物肥料，以促进土壤功能。 论文ID 原名：Bio-organic fertilizersstimulate indigenous soil Pseudomonas populations to enhance plant diseasesuppression 译名：生物有机肥可刺激原生土壤假单胞菌种群，增强对植物病害的抑制作用 期刊：MicrobiomeIF：11.607发表时间：2020.9 通讯作者：沈其荣 通讯作者单位：南京农业大学植物免疫重点实验室 试验设计 结果 1.病害发生率 在田间试验的3个生长季节中，生物有机肥处理(OF+W19和SOF+W19)(Duncan检验，P＜0.05)都能减少香蕉镰刀菌枯萎病的发生，与有机肥处理(SOF和OF)相比，OF+W19在每个生长季节的发病率最低(图1a)。SOF与OF处理之间，OF+W19与SOF+W19处理之间的发病率无显著差异（Duncan检验，P>0.05）。 从第二个生长季后土壤的扩增子测序数据中，我们还检测到OF+W19和SOF+W19处理的根际土壤中尖孢镰刀菌（Fusariumoxxysporum）的相对丰度比SOF和OF处理低（Duncan检验，P＜0.05）（图1b）。这一发现得到了定量菌落计数和qPCR分析的支持（图1b）。三种方法测定的发病率与根际土壤中的尖孢镰刀菌丰度呈正相关(P＜0.001，P＜0.001，P＝0.002)，并且发现病害发生率与根系土壤中可培养的尖孢镰刀菌丰度呈正相关(P＝0.04)。 2.微生物群落组成 非度量多维尺度分析(NMDS)表明，在根系和根际土壤的不同处理中，细菌群落组成(P(根系)=0.007，P(根际)=0.038)有显著差异，但真菌 (P(根系)=0.106，P(根际)=0.217)没有显著差异(图2)。总的来说，根系土壤中生物有机肥（OF+W19和SOF+W19）处理的细菌群落组成相当相似，并沿第一轴线(NMDS1)与有机肥（OF和SOF）处理有明显区别 (P＝0.012)(图2a)。在根际土壤中，有机肥处理组在一起并沿第一轴(NMDS1)与生物有机肥处理有差异(P＝0.027)(图2a)。对于真菌，在根系土壤中OF和SOF+W19处理分组，并与OF+W19和SOF处理有明显区别（P＜0.001）（图2b）。在根际土壤中，OF+W19和OF处理彼此相似，并与SOF+W19和SOF处理沿第一轴(NMDS1)不同(P＝0.005)(图2b)。在根系和根际土壤中，细菌群落组成可分组为两种生物有机肥处理和两种有机肥处理 (P(根系)=0.007，P(根际)=0.034)，而真菌群落在不同的施肥制度下没有表现出明显的规律(P(根系)=0.093，P(根际)=0.319)。 结构方程模型(路径分析)(图2c)显示，解释病害的最强驱动因素是病原体密度(r = 0.459，P = 0.003)，其受根际细菌群落组成的负面影响(r= -0.360，P= 0.015)。根系土壤细菌群落结构也在很大程度上决定了根际细菌群落组成（r=0.756，P=0.005）。此外，我们还评价了根系和根际土壤微生物群落与镰刀菌枯萎病发病率的相关性，发现只有根际细菌群落组成与病害发生率相关（Mantel检验，P＝0.01；PERMANOVA，P＝0.008）。 图2.所有根系和根际土壤样品中细菌（A）和真菌（B）群落组成的非度量多维尺度（NMDS）分析。（C）结合细菌和真菌群落结构，镰刀菌病原体密度和香蕉镰刀菌枯萎病发病率的结构方程模型。 3.响应性微生物分类群 我们进一步研究了哪些细菌OTUs与特定施肥处理以及香蕉枯萎病水平相关。基于线性判别分析(LDA)，233个根际细菌OTUs在不同施肥制度下存在差异。其中，与有机肥处理相比，43个OTUs在生物有机肥处理中富集（丰度增加2倍以上）。斯皮尔曼秩相关分析发现，34个OTUs与发病率有关（FDR<0.05）（图3a）。在这些响应的微生物类群中，假单胞菌的优势类群OTU7表现出特别模式，促使我们对这个OTU进行更详细的研究。假单胞菌OTU7在生物有机肥处理中的相对丰度最高， OF+W19和SOF+W19的平均丰度分别占总细菌群落的4.94%和3.27%（图3b）。相比之下，这种OTU在OF和SOF处理中分别只占总细菌群落的1.00%和1.25%（图3b）。此外，假单胞菌OTU7与镰刀菌枯萎病发病率呈负相关（P＜0.001）（图3c）。 4.接种的生防菌与原生土壤假单胞菌密度的关系 为了研究假单胞菌属是否对接种了生防菌的生物有机肥的投入有整体反应，我们考察了根系土壤和根际土壤中假单胞菌和芽孢杆菌的丰度。与两种有机肥处理相比，两种生物有机肥处理的根际土壤中检测到了更高的总菌数，并同时增加了根系和根际土壤中可培养的芽孢杆菌和假单胞菌的丰度(Duncan检验，P＜0.05)。我们观察到根际土壤的总菌数和可培养的芽孢杆菌和假单胞菌之间存在正相关关系(P＜0.001，P＜0.001，图3e)，而根系土壤的趋势并不显著(P＝0.095，P＝0.297；图3d)。此外，发病率与根际中总的和可培养的假单胞菌(P＝0.002，P＝0.007)以及总的和可培养的芽孢杆菌(P＝0.002，P＜0.001)的种群密度呈负相关，而可培养的芽孢杆菌(P＝0.03)和总的假单胞菌(P＝0.04)在根系土壤中表现出相同的趋势。 5.假单胞菌分离物及其对镰刀菌抑制，生物膜形成和芽孢杆菌吸引的特性 从生物有机肥和有机肥改良过的根际土壤微生物群中随机分离并鉴定了88株假单胞菌，代表了基于16S rRNA基因序列的14个不同系统发育组（图4a）。其中共有36个菌株对镰刀菌枯萎病原体Fusarium oxysporum f.sp.cubense(FOC)表现出拮抗活性，与从有机肥处理中分离的菌株相比，生物有机肥处理(OF+W19)的假单胞菌菌株表现出这种抑制作用的比例更大(t检验，P＜0.01，图4b)。OF + W19的根际土壤中有52％的假单胞菌分离菌株对枯草芽孢杆菌W19无影响，而有机肥（OF）改良的根际土壤中有74％的假单胞菌分离菌株显示出对W19的抑制作用（t检验，P＜0.01，图4b）。在单培养系统中，来自OF + W19和OF处理的假单胞菌分离菌株的生物膜形成之间没有显著差异。假单胞菌分离菌株与W19的共培养系统中，平均生物膜形成要比单培养系统中观察到的要大（Wilcoxon试验，P <0.001）。总体而言，来自OF + W19处理的假单胞菌分离菌株在改善双物种生物膜形成方面更为有效（Wilcoxon检验， P <0.001）。较高比例的假单胞菌分离菌株对W19的生物膜形成有刺激作用（t检验，P <0.05，图4b），而较少菌株对W19有拮抗作用（Wilcoxon检验，P < 0.001）。 6.假单胞菌PSE78菌株的抑病能力及其与枯草芽孢杆菌W19的潜在相互作用 我们利用盆栽实验研究了假单胞菌株PSE78抑制香蕉镰刀菌枯萎病害的能力。之所以选择该分离物，是因为它对尖孢镰刀菌表现出最强的拮抗活性，在生物膜形成中与W19有积极的相互作用，并且与反应性最强的OTU7表现出99%的序列同一性(图4a)。为了便于比较，我们还研究了一株没有这些特殊品质的菌株，即PSE82。PSE78菌株显示出强大的抑制枯萎病的能力（图5a）。与CK和其他处理相比，接种了PSE78处理的发病率较低（Duncan检验，P<0.05），平均值为12%，而接种了PSE82和未接种的SOF处理下发病率没有差异（Duncan检验，P>0.05）（图5a）。另外，在接种了PSE78处理的根际土壤中检出较高的假单胞菌和较低的尖孢镰刀菌种群密度（Duncan试验，P <0.05）。发病率与根际土壤中的尖孢镰刀菌和假单胞菌的种群密度之间也存在正相关和负相关性（P <0.001，P <0.001）。 为了研究假单胞菌和芽孢杆菌之间是否存在一般相关性，我们进一步检查了根际中原生芽孢杆菌的丰度。与其他处理相比，接种了PSE78处理的根际中的芽孢杆菌种群密度更高（Duncan试验，P <0.05）。芽孢杆菌和假单胞菌种群密度呈正相关（P <0.001，图5B），两者均与发病率呈负相关（P <0.001，P<0.001）。 我们进一步研究了PSE78和W19之间是否通过使用改良双重激发试验协同增强对FOC的抑制。实际上，分离株PSE78与W19结合对FOC抑制具有协同作用，因为两种菌株的结合产生的抑菌面积大于其单独行为所预测的抑菌面积。我们还深入研究了PSE78和W19对土壤中FOC的抑制可能产生的协同效应，并再次使用PSE82进行比较。虽然三种菌株单独施用时都在一定程度上降低了FOC密度，但当PSE 78和W19共同接种于实验土壤中时，FOC密度的降低幅度最大（图5c）。有趣的是，PSE82与W19的组合在抑制病原体方面的效果不如其中任何单独一种（图5c）。 图5.(A)与灭菌有机肥(SOF)和化学肥料(CK)处理相比，接种假单胞菌PSE78或PSE82的土壤中香蕉镰刀菌枯萎病的发病率。（B）香蕉根际土壤中芽孢杆菌和假单胞菌的种群密度之间的线性回归。(C)箱形图显示了在指定的预处理基质上生长的植物根部定植的FOC的数量。 讨论 本研究在自然发生病害土壤中，考察了生物有机肥在香蕉单株连作系统内对病害抑制的影响。我们利用接种或未接种镰刀菌枯萎病的生防菌W19的灭菌或非灭菌的有机肥设计实验，以剖析有机基质添加、肥料微生物组和接种生防菌株对病害抑制的相对贡献。我们发现，用W19重新接种灭菌堆肥产生的病害抑制程度与未灭菌的生物有机肥处理相当。更进一步，生物有机肥的总效应是生防菌对病原体的直接抑制作用以及由于原生土壤微生物群落重塑而产生的间接效应的总和，其中特定假单胞菌种群的作用尤为重要。 1. 生物有机肥料不同成分的相对重要性 我们的结果表明，用于生产生物有机肥的生防菌W19是有效抑制镰刀菌枯萎病的关键。相比之下，肥料的物理、化学特性和肥料基质上原生的微生物群对病害抑制水平没有影响。这些研究结果与以往的研究结果一致，即单纯的有机质改良往往无效，甚至有利于植物病原体的感染，然而在有机肥中加入合适的生防菌（如芽孢杆菌属、曲霉属等），可以有效减少镰刀菌病原体，从而控制植物病害。虽然在我们的实验中不能分别对W19和本土芽孢杆菌进行定量分析，但生物有机肥处理（接种W19的灭菌或非灭菌有机肥）中芽孢杆菌的种群密度较高，表明生防菌的投入是通过对植物病原体的直接拮抗作用增强了抑制病害能力。 2. 生防菌作为病害抑制剂对原生土壤群落的影响 我们发现所有四种肥料均导致微生物组结构发生特定变化，这一结果与先前追踪不同肥料管理方案的响应相似，且细菌群落比真菌群落受肥料处理的影响更大。我们观察到的对肥料的响应变化也可能与病害抑制水平相关（图2c），这意味着细菌群落的变化具有重要的功能后果。 我们观察到，含有生防菌的肥料处理导致假单胞菌属的相对密度显著增加，其中一种特定的显性OTU7表现出最强的响应。许多已知的促进植物生长的细菌都属于该属，假单胞菌属物种在先前的研究中表明与病害抑制有关。有趣的是，我们发现芽孢杆菌和假单胞菌的种群密度是相互关联的，而与尖孢镰刀菌密度和枯萎病呈负相关。我们进一步研究了这种相关性，发现与对照相比，在生物有机肥处理中较少的假单胞菌菌株显示出对W19的拮抗活性（图4b）。值得注意的是，一些假单胞菌的生长并没有被W19抑制，而是通过抗真菌代谢物对病原体表现出高度的拮抗作用。因此有可能通过富集原生微生物组中存在的拮抗假单胞菌，进一步强化了芽孢杆菌接种的效果，从而有效地抑制了病害。 3. 芽孢杆菌和假单胞菌联合作用抑制病原体的潜在机制 假单胞菌是广泛用于防治土传病害的生防菌，在抑制自然发生病害的土壤中，假单胞菌是微生物组的重要成员。然而，正如我们在研究中所发现的那样，假单胞菌属细菌在自然土壤中的多样性很高，并非所有的假单胞菌都会对病害抑制产生这种影响。作为假单胞菌属OTU7的代表，我们专门研究了PSE 78。虽然我们的研究无法证明假单胞菌OTU7和W19之间的相互作用是实验中发现的病害抑制水平的主要原因，但我们的数据（图5c）和其他报告已经表明，病害抑制往往可以归因于细菌种群的联合作用，而细菌种群的联合作用远不及单个病害抑制作用。我们的研究结果还表明，植物有益芽孢杆菌通过与这种特殊假单胞菌的正向相互作用，增加生物膜的形成和根系定植，在病害抑制中具有重要作用。我们发现分离的假单胞菌PSE 78可以在与W19共培养的生物膜形成中协同相互作用，表明在根部微生物组界面的群落组装中具有重要作用（图4b）。最近报道了通过交互式生物膜形成诱导植物病原体抗性的相似模式。其他研究也表明细菌种间相互作用可以增强生物膜的形成和微生物的适应性，从而潜在地触发微生物根定植和随后的植物抗病性。我们的数据支持这样的假设，即特异性刺激的假单胞菌种(PSE 78)与W19的联合作用导致香蕉根区内的FOC密度显著降低(图5c)。 我们的研究结果表明，由芽孢杆菌属和假单胞菌属组成的多菌种生物膜在根-微生物组界面的组装可以帮助保护植物免受病原体感染。控制病原体的其他机制可能涉及群体感应（QS）信号，铁载体介导的相互作用和系统诱导的根系代谢渗出物（SIREM）。在这里，我们报告接种特定的生防菌可以帮助刺激特定的有益于植物的相关微生物，这些微生物共同具有保护植物免受病原体侵袭的潜力。未来将有必要使用转录组学和蛋白质组学方法以确定这些根际微生物群落分子之间“对话”的本质以及它们的联合作用如何赋予抗病性。 评论 我们将实验结果总结为一个概念模型（图6），描述了施用生物有机肥抑制镰刀菌枯萎病的作用模式。生防菌W19在根际中可以（1）直接抑制病原体生长；（2）引起微生物组尤其是细菌部分的变化，对病原菌种群密度产生负面影响；（3）共激活根际微生物组中原生的有益与植物的相关微生物；（4）可能与特定的对植物有益的细菌属（例如假单胞菌属）激活多种生物膜的形成；（5）直接或间接限制真菌病原体感染植物根的能力。我们的实验设计使我们能够弄清生物有机肥料不同成分有效抑制病害的重要性。我们还可以深入了解如何促进原生的土壤假单胞菌，从而与生防菌共同作用以抑制病害。这些见解为特定管理措施如何抑制病害提供了新的机制基础，为更有效的应用开辟了新的机会。例如，未来的生物防治策略可能涉及共同接种协同作用的细菌，以专门促进土壤功能。此外，筛选潜在的生防菌株，不仅要看它们是否有能力拮抗相关病原体，而且要看它们是否有能力刺激潜在的协同原生种群。 图6.概念模型说明了在生物有机肥改良土壤中生长的植物根际发生的一系列事件（A至E）。描绘了生物有机肥引起的微生物群落组成和活动的变化，这些变化限制了真菌病原体的生长和随后对植物的侵染。
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