【原】科研| Hepatology：粪便微生物组可以区分酒精性肝炎与饮酒者，但不区分疾病严重程度

微科享 2021-04-19

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编译：晨曦，编辑：谢衣、江舜尧。

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导读

研究背景和目的：肠道微生物群在酒精性肝炎中的作用尚未确定。本研究的目的是：（1）研究酒精性肝炎患者粪便微生物生态特征；（2）研究微生物变化与疾病严重程度的关系；（3）推断微生物生态变化的功能相关性。

研究方法：将中、重度酒精性肝炎（MAH、SAH）患者的粪便微生物群与健康人（HC）和重度饮酒对照组（HDC）进行比较。16S热测序鉴定微生物类群。利用PICRUSt进行功能基因组学研究。采用LC/MS平台检测粪便短链脂肪酸（SCFA）。

分组：78名受试者（HC，n=24；HDC，n=20；MAH，n=10；SAH，n=24）

论文ID

原名：Fecal microbiome distinguishes alcohol consumption from alcoholic hepatitis but does not discriminate disease severity

译名：粪便微生物组可以区分酒精性肝炎与饮酒者，但不区分疾病严重程度

期刊：Hepatology

IF：14.971

发表时间：2020.2

通讯作者：Arun J. Sanyal M.D.

通讯作者单位：弗吉尼亚州里士满市弗吉尼亚联邦大学内科胃肠病学、肝病学和营养科

实验设计

实验结果

1 研究队列

共78研究对象入组，其中HC（健康）, n=24; HDC（酗酒对照）, n=20; MAH（中度酒精性肝炎）, n=10; SAH（重度酒精性肝炎）, n=24。

饮酒组中男性偏多。健康组比饮酒组年轻。酒精性肝炎患者胆固醇、白蛋白、血小板降低，AST、ALT、胆红素、白细胞计数升高；与酗酒对照组相比，酒精性肝炎患者的INR、MELD、Child-Pugh和DF评分更高；这些疾病严重程度的指标在重度酒精性肝炎组中最高。四组患者的心理状况相似。在重度酒精性肝炎患者中，抑酸药物（质子泵抑制剂或H2受体阻滞剂）的使用率较高（表1），但这个并不影响肠道菌群组成。

表1研究队列特征特征

2 饮酒引起的粪便微生物组分变化

为了确定饮酒的影响，首先比较酗酒组和健康组的微生物类群。与健康对照组相比，在门水平上，酗酒组富含厚壁菌门（49%比62%，p=0.08），同时拟杆菌门明显减少（46%比26%，p=0.01，图1A-B），与健康组相比，酗酒组的厚壁菌门与拟杆菌门的比率（2.39比1.05，p=0.02）高出127%（图1C-D）。尽管HDC的厚壁菌门/拟杆菌门的比率仍然较高于HC（图1D），厚壁菌门丰度从HDC-MAH-SAH呈逐步下降趋势（图1B和1E-F）。

从HC-HDC-MAH，变形菌门的比例略有增加。然而，与HC和HDC相比，SAH的变形菌门进一步显著增加（图1A-B和1E-F）。

图1 四组样本肠道菌群整体分布

3 酒精性肝炎的发生与粪便微生物群的明显变化有关

在属水平上，四个组之间的Shannonα-多样性差异显著。健康组和酗酒组无显著差异。中度酒精性肝炎的α-多样性呈下降趋势，重度酒精性肝炎进一步降低（图2A）。PCoA主坐标分析显示，四组的细菌组成有显著差异（图2B）。对照组（HC和HDC）与肝炎组（MAH和SAH）在PCoA图上明显分离，表明对照组（HC和HDC）与肝炎组（MAH和SAH）的微生物组成相似，但酒精性肝炎与对照组有明显区别。因此，酒精性肝炎的发生与微生物组成的明显变化有关，而微生物组成并不仅仅是简单的饮酒影响。

值得注意的是，在任何一组患者中，微生物组分的变化都是不均匀的。一些重度饮酒对照组（图2B中标记为70、68、39、76、59、43）的微生物群组成与中重度酒精性肝炎组相似。其中两名患者（标记为59和68）的MELD评分分别为10和8。另一方面，本组2例中度酒精性肝炎（60例，34例）和1例重度酒精性肝炎（54例）的微生物组分与重度饮酒对照组的微生物组分密切相关。这些患者的MELD评分分别为14、19和23分。一位重度酒精性肝炎患者（49个）的微生物群与健康对照组相似，此人的MELD评分为22分。异常值的微生物组成不能用联合用药来解释。

图2四组样本肠道微生物组内和组间差异分析

饮酒与酒精性肝炎引起的微生物群差异性改变。基于成对比较的LDA得分>2，在科和属水平上的特定细菌的差异富集如柱状图（图3）所示。对于每个对照组，富集分类群用一个水平条表示，其长度与该组富集程度相对应。

图3 特定菌群差异富集

饮酒与特定微生物群的差异富集有关。为了研究酒精摄入对肠道菌群的影响，将健康对照组的肠道菌群与高酒精摄入组（即HDC、SAH和MAH组）的肠道菌群进行比较。酗酒组中富含肠杆菌科、毛螺菌科、乳酸杆菌科和普雷沃氏菌科、糖类杆菌、链球菌科和维管菌科，在健康对照组中，酸氨基球菌科、类杆菌科、毛螺菌科家族的一些属等富含。

酒精性肝炎与粪便微生物组分的明显变化有关。为了评估肝炎对那些大量饮酒的人肠道微生物组分的影响，首先酒精性肝炎（MAH和SAH）与酗酒组比对，发现酒精性肝炎患者中含有丰富的环孢菌科、梭杆菌科和细脉菌科的几个属。在酗酒组中，富含来自科氏菌科的多个附加分类群，肠球菌科、毛螺菌科和瘤胃球菌科等。接下来比较MAH组与HDC组。在HDC富集科氏菌科和科氏菌科，以及毛螺菌科和瘤胃菌科科的几个分类群。MAH组中富含克隆菌科、肠球菌科、肠球菌科、消化链球菌科和维管菌科。其次，将SAH组与HDC组比较，发现SAH中富含放线菌科、环抱菌科、梭杆菌科、发酵糖杆菌科和细脉杆菌科，酗酒组中富含梭菌属、毛螺菌科和瘤胃球菌科。

酒精性肝炎人群中梭杆菌富集。为了进一步确定微生物群变化与酒精性肝炎严重程度的关系，比较了SAH与MAH肠道菌群。SAH中放线菌科和梭杆菌科增加。MAH中富含毛螺菌科和疣微菌科（健康组较肝炎组丰富）以及消化链球菌。

酒精性肝炎的微生物组学特征不同于单纯饮酒。为了研究微生物群从酒精性肝炎患者区分SAH的鉴别能力，比较所有饮酒过量的受试者（即HDC、SAH和MAH）。结果发现可以将酒精性肝炎患者从所有饮酒人中区分出来。采用K-fold交叉验证随机森林分类模型进一步对个体微生物群的判别能力进行排序。图4A左显示了前20个区别属的重度饮酒控制组和酒精性肝炎组的分类群相对丰度。在相对丰度较低的水平上观察到大多数有鉴别意义的分类群，而在酒精性肝炎中最丰富的分类群是细脉线虫科细脉线虫和拟杆菌科拟杆菌，而在酗酒对照中最丰富的分类群则是毛螺菌科毛螺菌。支持信息中提供了分类群属对模型预测精度的贡献排序。因此，酒精性肝炎可与酗酒对照组区分开来，仅根据微生物组分的预测准确度相对较高（AUC=0.826；图4B）。

饮酒组的微生物组分与MELD评分相关。利用MELD评分作为潜在酒精性肝炎的替代指标，我们还检测了所有饮酒组（HDC、MAH、SAH）的微生物组成。基于肠道菌群在属水平上预测MELD得分的随机森林回归模型，确定在前20个分类群中，最丰富的属是链球菌科链球菌、拟杆菌科拟杆菌属（图4A右）。

微生物组分不能区分中度和重度酒精性肝炎。比对了SAH与MAH进一步研究肠道菌群组成是否与酒精性肝炎严重程度相关。采用两种建模方法：一种以确定轻中度和重度酒精性肝炎；另一种将MELD评分作为一个关联。结果表明，肠道微生物组分不足以区分轻中度酒精性肝炎。且微生物群与MELD评分低关联，表明虽然肠道菌群组成虽然随酒精性肝炎的发展而变化，但它不是疾病严重程度的预测因子。

图4酒精性肝炎的发生与粪便微生物群的明显变化有关，而酒精性肝炎严重程度与粪便菌群无关

4 粪便中短链脂肪酸与差异肠道菌群关系

为了推断微生物生态变化与疾病严重程度的功能相关性，靶向分析粪便中代谢物短链脂肪酸（SCFA）以表征粪便微生物群差异的功能。SCFA被选作靶向代谢是因为SCFA与肠上皮屏障的完整性，肠道和全身炎症反应，包括肝脏炎症和肝代谢相关；此外，我们的数据表明，酒精性肝炎与毛螺菌科和瘤胃菌科家族的显著减少有关（图3，图5a），这两个家族是肠道中众所周知的SCFA产生者。

在MAH患者中，毛螺菌科的7/20个菌属和瘤胃菌科中的4/18个菌属减少（图3，第3栏）。在SAH中，毛螺菌科15/20个菌属和瘤胃菌科14/18个菌属减少（图3第4栏）。与HDC相比，MAH和SAH中毛螺菌科罗斯氏菌属均显著减少，而瘤胃菌科粪杆菌属仅在SAH中减少。

除了毛螺菌科和瘤胃菌科外，与HDC相比，其他已知的产SCFA的菌韦荣球菌科链型杆菌属在SAH中也减少了，但MAH中没有减少。然而，与HDC相比，已知的SCFA产生菌韦荣球菌科韦荣氏球菌属巨球型菌属在MAH和SAH中均富集。

同时，与HDC相比，SAH患者粪便中检测到的所有SCFA（乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐、2-甲基丁酸盐、异戊酸盐、戊酸盐和己酸盐）均显著减少（图5b）。与HDC患者相比，MAH患者的3种粪便代谢物（异丁酸、2-甲基丁酸和异戊酸）明显减少。然而，MAH和SAH的粪便SCFA浓度没有显著差异。

图5 短链脂肪酸与差异肠道菌群关联分析

5 差异肠道微生物与代谢物功能之间的关系

利用PICRUSt分析宏基因组学，以预测与饮酒和酒精性肝炎相关的肠道基因组功能潜能（图6）。

代谢途径的数量随着酒精的消耗而减少。与饮酒者（HDC/MAH/SAH）相比，HC组富含多种氨基酸代谢途径，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基酸相关酶、精氨酸和脯氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸、组氨酸、苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸生物合成途径，后一组患者的色氨酸代谢途径均较丰富。在碳水化合物代谢途径中，健康对照组的氨基糖、核苷酸糖、淀粉和蔗糖代谢较丰富，而饮酒组的抗坏血酸、醛酸和丙酸代谢较丰富。HC组鞘脂代谢丰富，饮酒组不饱和脂肪酸和脂肪酸生物合成丰富。HC组中富集多种能量代谢途径及外源物质代谢途径。

酒精性肝炎的发展导致了基因组的额外变化。与酒精性肝炎（MAH+SAH）相比，酗酒组精氨酸和脯氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径丰富，而酒精性肝炎患者中富集了色氨酸代谢、酪氨酸和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解途径。酒精性肝炎患者中维生素c、醛酸和柠檬酸循环途径更丰富。酗酒组体内富集了多种能量代谢途径和脂质代谢途径，而酒精性肝炎患者中富集葡聚糖生物合成代谢途径和外源性代谢途径。与MAH相比，HDC中外源性生物降解、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢和代谢更为丰富。此外，对比HDC与SAH，HDC中精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成氨基酸代谢途径含量丰富，SAH中色氨酸、酪氨酸、缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降解途径丰富。HDC中脂代谢丰富，SAH中多糖、多糖和外源性代谢途径丰富。最后，比较MAH与SAH，发现并无代谢途径在两者之间有显著差异。