【原】综述| SCI ADV：微生物组衍生的肉毒碱模拟物是此前未知的肠-脑轴沟通介质

微科享 2021-04-19

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编译：北越城主，编辑：谢衣、江舜尧。

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导读

肠道微生物组的改变往往与多种神经性疾病发生直接相关，然而目前研究人员并未得到证据表明肠道微生物组的代谢物与大脑之间存在直接的相互作用。近期，研究人员在小鼠的肠道和大脑中鉴别出了两种新型的细菌代谢物3-甲基-4-(三甲胺)丁酸酯（3M-4-TMAB）和4-(三甲胺)戊酸酯（4-TMAP），他们利用质谱成像技术（MSI，mass spectrometry imaging）在这些分子扩散到大脑不同部位之前绘制出了其分子图谱。在小鼠大脑特殊区域中发现的特殊分子与肉碱（carnitine）拥有相似的结构，本研究描述了其能建立菌群-肠-脑轴（MGB）之间的直接关联，阐述了其在神经性疾病发生状况下扮演的关键角色。

论文ID

原名：Microbiome-derived carnitine mimics as previously unknown mediators of gut-brain axis communication

译名：微生物组衍生的肉毒碱模拟物是此前未知的肠-脑轴沟通介质

期刊：Science Advances

IF:12.80

发表时间：2020.03.11

通讯作者：Daniel M Wall

通讯作者单位：格拉斯哥大学

内容

1. 质谱成像（MSI）发现来自GF和SPF小鼠体内差异代谢物

为了鉴定介导菌群-肠-脑轴（MGB）轴交流的未知菌群代谢产物，我们使用了质谱成像（MSI）来鉴定无特定病原体（SPF）C57BL小鼠和无菌小鼠（GF）C57BL之间肠道和大脑中都存在的差异的菌群代谢物。我们通过基质辅助激光解吸电离法(MALDI)-MSI和解吸电喷雾电离法(DESI)-MSI检测小鼠肠道和大脑中质荷比（m / z）为160.133的代谢物分子，发现SPF小鼠的代谢物浓度水平比GF小鼠高20倍（图1和图S1）。MALDI-MSI用于获取脑区域分析的高横向分辨率图像，而DESI-MSI用于进一步的高光谱分辨率分析。在GF小鼠中检测发现其代谢物水平与组织阴性对照的基线相当（图S1）。该代谢物分子临时称为Met1，在大脑的白质区域（髓质，胼胝体和小脑活树）特别丰富（图1B）。

图1 来自C57BL / 6 GF和SPF小鼠的脑和肠切片上的MALDI-MSI（A）脑组织的苏木精和曙红染色切片（上）和MALDI-MSI图像（下），MALDI-MSI技术显示在m / z 160.133处发现了一个峰，该峰在GF小鼠中不存在，但存在于SPF小鼠脑中的离散位置；（B）SPF大脑不同区域中m / z 160.1的相对丰度的条形图，以及整个大脑的平均值；（C）该代谢产物也存在于SPF结肠中，但在GF结肠中不存在。注释：Cb，小脑；arb，小脑活树；MO，延髓；P，脑桥；MB，中脑；cc，胼胝体；fr，束状反射。

图S1（a）GF和SPF小鼠大脑的平均MALDI-MSI（上图）和DESI-MSI（下图）的质谱图；（b）MALDI-MSI和DESI-MSI实验的放大平均光谱显示出m / z 160.133处的峰；（c）光谱重叠光谱显示在GF和SPF小鼠中检测到相似的峰，在GF光谱中看不到m / z 160.133的峰。

2.差异代谢物来源于体内的肠道菌

由于在GF小鼠中检测到的代谢物Met1水平与阴性对照相当，因此表明该化合物在SPF小鼠中的来源于肠道菌群微生物。因此，我们确定了用不可吸收的抗生素混合物（ABX）治疗7天是否可以减少结肠中的Met1。观察到该处理可显着降低Met1水平（P≤0.05），确认Met1是由肠道微生物代谢产生（图S3）。接下来，我们从C57BL / 6小鼠的肠道菌群中筛选出能够产生Met1的肠道菌群菌株。从鼠粪中分离出的细菌菌株在厌氧菌肉汤（FAB）琼脂平板上生长，然后将菌落重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并点到载玻片上，通过MSI筛选Met1。通过16S rDNA测序确定梭状芽孢杆菌和共生梭状芽孢杆菌 (Clostridium clostridioforme and Clostridium symbiosum)（图2）。两种菌株都是形成肠孢子的人类肠道共生体，它们都属于厌氧菌，而梭状梭状芽胞杆菌也是条件致病菌。

图2. DESI-MSI用于筛选肠道细菌产生目标代谢产物。测试的细菌菌株： (A) C. symbiosum LM19R, (B) C. symbiosum LM19B, (C) C. clostridioforme LM41A, (D) C. symbiosum LM42D, (E) Bifidobacterium animalis LM33, (F) Lactobacillus animalis LM31, (G) Propionibacterium spp. YM23, (H) Clostridium difficile LM27, (I) Enterococcus faecalis YM13, (J) Bacteroides fragilis NCTC 9343 (type strain), (K) C. clostridioforme NCTC 11224 (type strain), (L) C. clostridioforme NCTC 7155 (type strain), (M) blank control, (N) blank control, (O) C. symbiosum LM19R, and (P) Escherichia coli F18.

图S3 用抗生素治疗7天的小鼠结肠切片的MALDI-MSI表明，与对照组相比，用抗生素治疗的小鼠结肠中m/z 160.1的代谢产物减少。（a）肉毒碱图像（m / z 162.1）显示为对照，以证明在抗生素治疗的小鼠中代谢产物并未普遍减少；（b）与对照相比，经抗生素处理的小鼠结肠中m/z 160.1离子强度（通过TIC标准化）的箱形图；（c）在一周的ABX处理小鼠粪便上进行肠道微生物组的16S rRNA基因测序和分析，并与未处理的对照组进行比较，ABX和无ABX样品之间16s rRNA基因序列分析；（d）16S rRNA基因测序的未加权UniFrac的PCoA分析；（e）描绘在经过和未经过ABX处理的肠道微生物组中门的相对丰度的分类图。 ABX处理导致少数更占优势的操作分类单位（OTU）减少，从而可以建立独特的OTU，从而增加其在菌群中的比例。

3.对菌群产生的差异代谢物进行结构确定

在此测试的其他梭菌菌株均未产生该分子，并且在所有测试的梭状梭菌菌株中均未检测到其产生，包括梭状梭菌型菌株NCTC11224（图2）。为了确保细菌代谢物是Met1而不是结构异构体，我们对梭状梭状芽孢杆菌的m / z 160.133和鼠脑的Met1进行了串联质谱分析（MS/MS）。来自不同来源的Met1产物离子质谱匹配，证实来自鼠脑和梭状梭菌的分子在结构上相同（图S4）。根据获得的MS /MS质谱，我们得出结论，Met1在结构上与肉碱类似，因为观察到两个指示的三甲胺基团质量碎片（m /z 58.066和m/z 60.081）以及质量差。羧酸基团（m / z 101.060和m / z 55.055的产物离子之差）。此外，生成的MS / MS谱图看起来与先前报道的5-氨基戊酸甜菜碱（5-AVAB；也称为N-三甲基-5-氨基戊酸）具有相似的m / z 160.133。但是，在MS / MS碎裂过程中，我们注意到在Met1与合成的5-AVAB标准品之间具有更高的碰撞能量时，m / z 60.081和m / z 55.055处的峰强度存在明显差异，这使我们怀疑Met1为5-AVAB（图S5）。为了明确阐明其结构，我们对包含Met1的细菌进行了核磁共振（NMR）相关光谱法（¹H-¹H COSY）。NMR确定Met1是仅在甲基侧链位置不同的两个结构异构体的混合物，位于C3 [3-甲基-4-(三甲基铵)丁酸(3M-4-TMAB)]或C4 [4-(三甲基铵)戊酸酯(4-TMAP)]的结构（图3）。NMR分析还显示，细菌与同族分子γ-丁甜菜碱（GBB）并以等摩尔比产生代谢产物。在梭状梭菌中检测到GBB以及3M-4-TMAB和4-TMAP，表明它可能是这些分子的前体，也是肉碱的直接前体。然而，与3M-4-TMAB和4-TMAP不同的是，GBB是由一系列肠道细菌和哺乳动物细胞合成的，这意味着追踪3M-4-TMAB和4-TMAP的细菌合成产生的GBB是不可能的。

图3.粗提液的¹H-¹H COZY显示了三种相关的三甲基铵衍生物的出现。交叉峰已进行了相应的彩色标记，而光谱上显示的线表示相应衍生物：3M-4-TMAB（绿色）和4-TMAP（红色）以及去甲基化同源物GBB（黑色）中相邻偶联质子之间的相关性。

图S4 对大脑中发现的代谢物和梭状梭状芽孢杆菌产生的相同m / z（160.133）的代谢物进行了MS / MS分析。在一定范围的HCD产生的相应的较小产物离子表明代谢物相同。m / z 60.081和58.066的峰表明存在三甲胺基团。m / z 101.060和55.055之间的产物离子之间的差异表明羧基的损失，也与猜测的结构一致。

图S5 来自MS / MS分析的合成标准5-AVAB质谱与大脑中的内源性代谢产物的质谱图m / z为160.133。MS / MS分析是在各种能量HCD15、25、35、50、65、75和100下进行的。在较低的碰撞能量（HCD15-35）下，显示了一个完整的光谱，m / z 50-180，但是在较高的碰撞能量（HCD50-100）下，该质谱被缩放以显示一个m / z 50-120的范围。在HCD 65和75处，在55.055处出现了明显的峰差异，与来自大脑的m / z 160.133相比，在5-AVAB中明显更低。

4.差异代谢物与肉碱的空间共定位

因为3M-4-TMAB在结构上与肉碱高度相似，而4-TMAP与肉碱的直接前体GBB相似，所以我们使用MSI来检查3M-4-TMAB和4-TMAP与肉碱在SPF小鼠脑中的共定位。肉碱是脂肪酸氧化（FAO）的重要介质，它以酰基肉碱的形式将长链脂肪酸穿过膜穿入线粒体，并在那里被分解。使用MALDI-MSI进行肉碱的可视化，并使用DESI-MSI获得准确的m / z（162.112）以进行后续鉴定（图4）。来自MALDI-MSI和DESI-MSI的m / z 160.1和m / z 162.1的质谱图如图2所示。使用SpectralAnalysis对3M-4-TMAB / 4-TMAP和肉碱的MSI图像进行处理。计算了m / z 160.1（3M-4-TMAB和4-TMAP）和m / z 162.1（肉碱）的高强度区域的重叠，并确定了每个分子在三个截面上的这些分子的Pearson相关系数。结果表明，信号与大脑中3M-4-TMAB和4-TMAP与肉碱之间的空间共定位（Pearson相关性：SPF1，0.921547; SPF2，0.906855; SPF3，0.609946）之间存在明显的重叠，以及许多其他分子皮尔逊相关系数超过0.8（图4）。还确定了GF小鼠大脑中m / z 160.1和m / z 162.1的Pearson相关系数，发现它们的存在不相关（Pearson相关：GF1，-0.12976； GF2，-0.00027； GF3，0.177441）。这进一步表明，在GF小鼠脑中检测到的m / z 160.1信号可能是由质量相似的分子（如图S1B中所述）导致的，而在本研究中无法解决。为了确保SPF小鼠中的分子共定位是相关性的基础，而不是基于组织的离子抑制变化，在分析之前还应用了总离子归一化。这表明在m / z 162处的肉碱是与3M-4-TMAB / 4-TMAP相关的前3个高度相关的分子。因此，除了在结构上与肉碱及其前体相似外，还在大脑内的相同位置发现了3M-4-TMAB和4-TMAP。

图4. MALDI-MSI转换为二进制图像，显示了m / z 160.1(3M-4TMAB / 4-TMAP)和m / z 162.1（肉碱）离子图像的高强度（黑色）和低强度（灰色）区域。然后，将这些区域的重叠计算为m / z 160.1图像的高强度区域中像素的百分比，该像素在m / z 162.1图像中也是高强度的。此外，针对三个生物重复样本（SPF1，SPF2和SPF3）中的每个组织，计算了两个图像之间的Pearson相关系数，系数1表示完全共定位，而-1表示没有共定位（SPF1重叠92.85714，Pearson相关系数0.921547；SPF2 93.20652、0.906855；SPF3 63.20542、0.609946）。

5. 3M-4-TMAB和4-TMAP代谢物在GF小鼠脑内的浓度水平

根据3M-4-TMAB和4-TMAP代谢物的结构特征，合成每种标准物，并通过MSI定量SPF脑中的内源性浓度。通过NMR确定3M-4-TMAB和4-TMAP在细菌样品中以等摩尔水平存在（图3）；因此，将3M-4-TMAB和4-TMAP的标准品均匀混合，并在MSI分析之前通过在GF脑中标出确定浓度的标准品来生成标准浓度曲线。这被用来确定SPF脑中内源性代谢物的浓度。整个大脑中代谢产物的平均浓度确定为0.37至0.4 μM。胼胝体和海马体的平均浓度较高，约为13至17.1 μM，表明在这些区域中3M-4-TMAB / 4-TMAP显着积累（图5）。

图5对小鼠大脑中的3M-4-TMAB和4-TMAP进行定量（A）制备3M-4-TMAB和4-TMAP标准品的等摩尔混合物，并以各种浓度将其点样在GF脑切片上；（B）来自MSI结果的每个点的m / z 160.133离子强度用于生成相对于每个点中标准量的浓度曲线；（C）浓度曲线用于计算整个大脑，高丰度区域，胼胝体和海马区中3M-4-TMAB和4-TMAP的平均内源浓度。

6. 3M-4-TMAB和4-TMAP抑制宿主细胞中的肉碱功能

考虑到细菌代谢产物3M-4-TMAB和4-TMAP与宿主肉碱之间观察到的结构相似性和空间共定位水平，我们假设这些细菌代谢物分子可能抑制宿主细胞中的肉碱功能。我们使用合成的3M-4-TMAB和4-TMAP在XF棕榈酸-牛血清白蛋白(BSA) FAO底物测定方法，在中枢神经系统（CNS）白质鼠细胞培养模型中测试了它们在肉碱存在下抑制线粒体功能的能力。该测定法以耗氧率（OCR）作为读数来测量FAO，因此使我们能够评估一种分子是否能够抑制FAO。在0.5 mM肉碱和3M-4-TMAB和4-TMAP分别存在或以2 mM联合存在的条件下，将小鼠脊髓衍生的细胞体外培养8天，持续24小时。仅单独使用3M-4-TMAB（在四个生物学重复中减少了12％），通过4-TMAP（减少了14％）或通过等摩尔的3M-4-TMAB / 4-TMAP混合物（17％）对FAO进行了显着抑制减少（图6）。所见的抑制作用与埃托莫西的抑制作用相当（减少25％），后者是FAO的不可逆抑制剂。此外，在不向肉毒碱和培养基中添加肉碱的情况下，以20 μM的组合测试3M-4-TMAB和4-TMAP，表明在鼠脑中3M-4-TMAB和4-TMAP的浓度与发现的浓度相似，可能显着减少白质细胞中的FAO。

图6.在存在3M-4-TMAB和4-TMAP的情况下，OCR被用作FAO的指标。在肉碱和所示浓度的3M-4-TMAB，4-TMAP或3M-4-TMAB和4-TMAP的组合存在下，在原代鼠科髓鞘型CNS白质培养物中，棕榈酸酯的氧化显着降低。依托莫西非，FAO的不可逆抑制剂被用作对照。每个符号代表一个实验的相对平均值（n = 4）。通过合并来自一只怀孕雌性小鼠的所有胚胎的游离脊髓细胞，获得了用于生成CNS白质模型的神经前体。