【原】科研|PLoS Med：妊娠期糖尿病及其发展为2型糖尿病的氨基酸和脂质代谢：代谢谱研究

微科享 2021-04-19

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编译：阿温，编辑：谢衣、江舜尧。

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导读

背景：有妊娠期糖尿病(GDM)史的女性在中年期间患2型糖尿病(T2D)的风险比正常人高7倍，患高血压和心血管疾病的风险也比正常人高。建议分娩后对葡萄糖耐量进行重新分类，但只有不到40%的GDM孕妇接受了检测。因此，需要改进风险分层方法，以及更深入地了解GDM向T2D转变的病理基础。于是，我们假设产后早期的代谢物可以准确地区分从GDM到T2D的发展风险，且代谢物的变化预示着未来疾病发展的潜在病理生理学。

研究方法：该研究使用了1035名GDM女性患者的空腹血浆样本。研究对象包括2008年至2011年间在Kaiser Permanente北加州医院分娩的不同种族/民族的孕妇(33%为初产妇，37%为双胎产妇，30%为多胎产妇)。在病例对照研究设计中，我们收集了基线处无糖尿病妇女的空腹血浆样本，以测量其后来发展为T2D或未发展为T2D(非T2D)的代谢物。在基线后2年，我们分析了98例T2D患者和239例对照者的样本，以揭示T2D相关的代谢变化。纵向分析追踪个体从基线到随访2年的代谢变化，作为T2D发展的轨迹。

结论：在这项研究中，我们发现了一个在产后早期预测从GDM到T2D的代谢特征，且优于临床参数(空腹血糖、2小时血糖)。研究结果表明，代谢失调尤其是AA代谢紊乱出现在糖尿病发作的前几年，并且在GDM妇女的产后早期和发展为T2D之前也被发现。

论文ID

原名：Amino acid and lipid metabolism in post-gestational diabetes and progression to type 2 diabetes: A metabolic profiling study

译名：妊娠期糖尿病及其发展为2型糖尿病的氨基酸和脂质代谢：代谢谱研究

期刊：PLoS Medicine

IF：11.048

发表时间：2020.5.20

通讯作者：Michael B. Wheeler

通讯作者单位：多伦多大学医学院

实验设计

实验结果

1. 队列研究概述

在SWIFT队列中，共招募了1035名妊娠期间诊断为GDM的妇女，并在产后6至9周时纳入研究(研究基线)。在这些患者中，1010名妇女在基线时进行2小时75克OGTT的结果中没有发现T2D。在这1010名女性中，959名随后完成了每年的亲自访问研究，包括研究2小时OGTTs到基线后2年(95%队列保留)，以重新分类葡萄糖耐量，并/或在基线后8年内在KPNC电子健康记录中进行了额外的血糖测试，以诊断T2D新的发病。在SWIFT研究基线(2008年至2011年)和基线后1年和2年(2009年至2014年)的每个亲自随访研究中收集空腹血浆样本。截至2017年12月， 959名在基线及进行后续测试的妇女中没有发现T2D，178名妇女(18%)在基线后发生了T2D(图1A)。在病例对照研究设计中，我们根据糖尿病状态和随访时间选择参与者进行匹配，173例T2D病例(5个基线样本无法被衡量)和485例非T2D对照(总共658名女性)，在她们产后6-9周之前获得空腹血浆样本，并进行代谢组学分析(基线)。此外，来自同一队列随访的空腹血浆样本也进行代谢组学分析(98例T2D病例和239例配对的非T2D对照) (图1A和图1B)。数据分析由3个部分组成：(1) T2D病例和非T2D对照的基线代谢物分布差异建立T2D新发病的预测模型，并描述与GDM向T2D过渡相关的代谢变化；(2) 随访样本与糖尿病病例对照情况的横断面分析，揭示T2D相关的代谢途径；(3) 通过追踪个体内的代谢变化，进行纵向分析以形成并呈现T2D进展的轨迹(图1C)。

图1 GDM妊娠后女性，婴儿喂养和2型糖尿病(SWIFT)的队列研究以及研究设计。

2. 队列研究临床特点

表1总结了基线时的社会人口学和临床参数。在产前特征方面，后期患T2D的妇女与未患T2D的妇女在年龄、种族或平等性方面没有显著差异。T2D病例组的孕前BMI (p < 0.001)和产前3小时100 g OGTT(葡萄糖值的4个z得分之和；空腹以及禁食1小时、2小时、3小时，p < 0.001)均高于匹配的非T2D对照组，与959名整个队列的妇女进行1年或2年后续血糖检测的结果相似。与非T2D对照组相比，T2D病例组中有糖尿病家族史的人员比例更高(p = 0.018)，且在妊娠期间曾接受胰岛素或口服药物治疗(p < 0.001)。在研究基线处，与对照组相比，T2D组的女性有更高的BMI (p = 0.02)、FPG、2小时血糖(2hPG)、空腹胰岛素和2小时胰岛素(p值均< 0.001)；并且升高了空腹甘油三酯(TAG) (p = 0.005)，空腹ln甘油三酯(p = 0.002)，胰岛素抵抗的稳态模型评估(HOMA-IR) (p < 0.001)以及千卡作为动物脂肪在饮食摄入中的百分比(p = 0.006)，但降低了空腹高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) (p = 0.008)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) (p = 0.044)。空腹总胆固醇、细胞功能稳态模型评估(HOMA-B)、高血压百分比、吸烟者百分比、饮食血糖指数、基线体力活动评分在T2D患者和非T2D对照组之间无显著差异。

表1 SWIFT队列中妊娠期糖尿病妇女的产前和研究基线(产后6-9周)的特点。

3. 开发预测T2D的代谢信号

我们发现了一个由20个代谢产物组成的特征——己糖、6个AAs、6个甘油磷脂、2个酰基肉碱、2个鞘脂类和3个生物氨(图2A)。在每个随机采样的训练集中使用20个代谢物特征生成一个预测模型。将模型应用于相应的输出测试集中进行验证，并通过AUC、灵敏度、特异度、精密度、F1得分、准确度对模型的预测性能进行评价。模型生成和评估的过程重复了100次。常规的临床参数FPG和2hPG也采用同样的方法进行预测分析。利用20种代谢物的特征，我们得到预测性能中位数±SD值AUC = 0.88±0.03，灵敏度0.78±0.05，特异性0.80±0.07，精密度0.79±0.06，F1得分0.79±0.04，准确度0.79±0.04，优于传统临床参数FPG和2hPG或其组合(图2B)。为了避免任何偏好偏差，我们选择了具有中值性能的训练/测试分区来表示接收工作特性曲线，以比较基于不同参数构建的模型(图2C)。利用该特征，我们得到AUC为0.883 (95%CI = 0.820-0.945，p < 0.001)，优于FPG (AUC = 0.69，95%CI = 0.597-0.801，p < 0.001)，2hPG (AUC = 0.694，95%CI = 0.593-0.795，p < 0.001)，以及它们的组合(AUC = 0.745，95%CI = 0.649-0.840，p < 0.001)。有趣的是，当将临床参数(FPG或2hPG)添加到20个代谢物特征中时，两种临床参数的识别率都没有提高，只有轻微的提高(图2D)，这说明使用代谢物特征来预测糖尿病的意义。总之，我们开发了一种可以预测T2D的代谢特征，AUC为0.88±0.03。这表明代谢变化在T2D发病前发生，这使我们能够预测糖尿病并进一步探索与T2D发病相关的代谢变化。

图2 预测未来2型糖尿病的代谢特征和模型。

4. 基线前瞻性分析：与T2D发展相关的代谢变化

在188个被测代谢物中，有141个经过数据预处理并进行生物信息学分析。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示了T2D病例与非T2D对照之间的可分离性，以及发病前2组间不同的代谢特征。为了进一步描述T2D病例和非T2D对照样本之间差异表达的代谢物，我们对单个分析物进行线性回归模型，并进行方差分析以评估其意义。这些模型根据种族、年龄和BMI进行了调整。发现37种代谢物在T2D病例和非T2D病例中有差异表达，具有统计学意义(FDR < 0.05)，包括23个上调代谢物和14个下调代谢物(图3A和图3B)。我们和其他研究者均报道己糖在T2D病例中增加。在本研究中，基线时己糖是最显著的代谢物(FDR < 0.001)，非T2D组为5.45±0.8 mM，T2D病例组为6.10±0.1 mM。这表明己糖代谢是最受调控的，与发病密切相关。

在T2D发病组和非T2D对照组之间，AA代谢也发生了改变。11种AAs (组氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸和脯氨酸)上调，只有谷氨酸下调。酰基肉碱和生物胺(与AA代谢有关)也受到影响。其中，在T2D发生前观察到酰基肉碱AC3 (FDR = 0.01)、AC10 (FDR = 0.005)、AC16 (FDR < 0.001)增加。亚精胺，一种生物胺，发现其增加，而另一种胺，犬尿氨酸却减少。除了这些代谢物外，鞘磷脂也被发现减少，这与我们之前的研究报道一致。同样，溶血磷脂酰胆碱(lysoPCs)也下降，但lysoPC26:0除外。有趣的是，在上调组别和下调组别中都检测到来自甘油磷脂组的分析物。上调的甘油磷脂为PC aa C组(二酰基甘油磷脂)，下调的甘油磷脂为PC ae C组(酰基烷基甘油磷脂)。

发展为T2D前的研究基线时，37个差异表达代谢物与临床参数(BMI、FPG、2hPG、空腹胰岛素、HOMA-IR、HOMA-B)的相关性见图3C。正如所料，己糖与FPG的相关性最高(r = 0.58，p < 0.001)。它还与空腹胰岛素(r =0.30，p < 0.001)和HOMA-IR (r = 0.36，p < 0.001)相关，而与HOMA-B无关(r = 0.01，p = 0.71)。相反，代谢物与BMI或2hPG(−0.20 < r < 0.20)的相关性较低。大部分AAs(及其衍生物)和PC aa C组与空腹胰岛素、FPG、HOMA-IR呈正相关，而PC ae C组与鞘脂类呈负相关。BCAAs(亮氨酸、异亮氨酸)、谷氨酸、酪氨酸与空腹胰岛素和HOMA-IR 呈正相关。酰基肉碱AC3也与空腹胰岛素和HOMA-IR呈正相关。

为了进一步研究T2D发病的分子通路并寻找受影响的生物学通路，我们使用KEGG进行通路分析。与非T2D对照组相比，在随访期间发现向T2D过渡的女性出现了KEGG中氨酰基-tRNA生物合成途径(FDR < 0.001)、BCAA生物合成(FDR = 0.004)和精氨酸生物合成(FDR = 0.017)上调(图3D)。有趣的是，精氨酸/脯氨酸代谢(FDR = 0.024)也被上调(图3D)。这些发现表明，过度活跃的AA代谢可能在糖尿病发病中发挥重要作用。

图3 基线时与未来2型糖尿病(T2D)有关的代谢物和通路。

5. 随访横断面分析：与T2D相关的代谢变化

随访样本(173例随访样本中98例为T2D，而485例随访样本中239例为配对非T2D对照)进一步采用横断面分析，以鉴定T2D相关代谢物。与基线时观察到的情况类似，根据PLS-DA评分图中的差异代谢情况，可以将T2D参与者与非T2D参与者分离开，这表明T2D参与者与非T2D参与者之间有显著的代谢变化。其中，T2D组与非T2D组相比，共鉴定出27个差异代谢产物，具有统计学意义(p < 0.05)，其中9个上调，18个下调。己糖(可能主要是葡萄糖)增加，且其显著性最高(p < 0.001)。这与T2D的临床诊断一致。值得注意的是，在所有27个差异调节代谢产物中，T2D组中6个AAs(谷氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸)、PC aa C32:1和AC5均高于非T2D组(图4A和4B)。相反，T2D与非T2D相比，另外14种甘油磷脂、1种AA(甘氨酸)、1种生物胺(肌酐)和2种鞘磷脂[SM(OH)C22:2和SM(OH)C14:1]在血清中降低(图4A和4B)。这些被调节的代谢产物，包括碳水化合物(葡萄糖和果糖)，脂质(磷脂和鞘磷脂)，AAs (BCAAs，芳香AAs，甘氨酸)，以前在T2D组(一般成人人群)中报道过。个体的代谢物丰度在参与者之间显示出差异。

为了进一步了解与T2D相关的代谢变化，我们对所有差异代谢物进行了KEGG通路分析。与我们在基线上的发现相似，KEGG通路分析表明AA代谢受到了严重影响。T2D参与者中氨酰基- tRNA生物合成途径富集最多(FDR < 0.001)， KEGG中BCAA生物合成和降解途径富集最多(FDR < 0.001和FDR = 0.023)(图4C)。更重要的是，葡萄糖-丙氨酸循环通路被上调(FDR = 0.013)，在这个通路中氮进入尿素循环并生成葡萄糖(图4C)。

在图4D中比较了基线和随访期间差异调节的代谢产物。在基线时升高的己糖在随访中显示出更大幅度的升高(增加15%)。大多数AAs维持相同的模式(增加或减少)，除了组氨酸和丝氨酸，它们在基线时增加，但在随访时减少(图4D)。大部分磷脂(lysoPCs和PC ae C组，除了lysoPC a 26:0、16:0、18:0和PC ae C38:1)和鞘脂在两个时间点上均保持下降趋势(图4D)。相反，磷脂的PC aa C组(除了PC aa C38:1和C38:6)在两个时间点上都保持了上升趋势。亚精胺和肌酐在两个时间点维持其模式，而犬尿氨酸在基线时下降，但在随访时上升(图4D)。基线时AC3、AC10、AC16升高，随访时恢复正常，但AC5升高(图4D)。大多数在基线时鉴别出的差异调节代谢物在随访时保持了它们的变化。

图4 随访时与2型糖尿病(T2D)相关的代谢物。

6. 纵向分析：与GDM向T2D转化相关的个体的代谢物

为了进一步研究代谢物动力学并阐明T2D发病前的代谢路径，我们追踪了每个个体体内代谢物的动态变化。在这项纵向分析中，我们选择了337名参与者，他们在基线和随访时都进行了分析。随访中共98名患者发展为T2D，被定义为发展者，239名患者未发展为T2D，被定义为非发展者(图5A)。通过使用多元线性回归模型，我们确定了10种代谢产物，它们在发展者和非发展者之间的发展过程中发生显著变化(p < 0.05, FDR < 0.2)。这10种代谢物——己糖、5种AAs、1种生物胺和3种磷脂——与糖尿病发展的代谢变化相关(图5A)。追踪每个人体内每种代谢物的相对浓度变化，从而形成每种代谢物随时间变化的轨迹(图5B)。具体来说，在糖尿病发展期间，己糖和犬尿氨酸的delta值升高，而其余8种代谢物(组氨酸、丝氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、赖氨酸、lysoPC a C18:0、lysoPC a C18:1、PC ae C34:2)的delta值下降(图5B)。纵向分析显示，这10种代谢物的delta值变化有助于T2D发展(图5B)。与横断面分析(基线和随访)相比，这里发现的差异异常代谢物少得多，这表明在整个T2D发展过程中，大多数基线时的代谢变化保持不变。

图5 纵向研究中与2型糖尿病(T2D)进展相关的代谢物。

7. 建立从GDM到T2D转变的代谢谱：整合基线/随访的横断面分析和纵向分析

选择基线/随访横断面和纵向分析中检测到的所有差异表达代谢物，建立GDM向新发病T2D过渡期间的综合代谢剖面(图6A)。在基线和随访中，己糖、大多数AAs(包括BCAAs和芳香AAs)、酰基肉碱(AC3和AC10)、生物胺(亚精胺)和二酰磷脂酰胆碱在T2D中均升高(图6A)。相反，谷氨酰胺、甘氨酸、鞘磷脂、lysoPCs和酰基-烷基-磷脂酰胆碱水平与T2D呈负相关(图6A)。与基线和随访的横断面研究不同，在纵向研究中只有10种代谢物受到差异调节。纵向分析显示，在过渡期间，己糖和生物胺-犬尿氨酸的delta值增加，而组氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸和瓜氨酸的delta值则减少(图6A)。磷脂lysoPC a C18:0, lysoPC a C18:1, and PC ae C34:2的delta值也降低。在纵向分析中没有统计学变化的T2D病例个体的分析物在对照组和基线病例之间是一定不同的(图6A)。这表明，GDM发展为T2D的女性在基线(产后)存在代谢异常，包括碳水化合物、AAs、酰基肉碱和脂类的代谢网络(图6B)。

图6 一个假定的模型描述了从妊娠期糖尿病(GDM)到2型糖尿病(T2D)转变过程中的代谢变化。

讨论

在目前的研究中,有针对性的分析物（其中许多以前与糖尿病风险相关）的代谢组学常被用来评估代谢变化特征明显、种族和族裔多元化的GDM妇女的代谢变化，这些研究对象在产后早期（6至9周）接受了测试，并随访了8.4年的时间。我们在产后早期发现了一个独特的代谢特征，它可以预测未来的T2D，其预测能力为AUC 0.883。为了进一步解释从GDM到T2D转变的病理生理学，我们进行了横断面和纵向分析。基线时，最惊人的发现是AA代谢、精氨酸/脯氨酸代谢和BCAA代谢的上调。在随访的发展为T2D的患者中，AAs的上调持续或加强。纵向分析显示只有10个代谢物与T2D进展相关。

本研究对有GDM病史女性的T2D早期诊断中代谢特征的潜在效用进行了深入研究。使用机器学习，我们确定了20个代谢物(跨越3个主要代谢物组，包括碳水化合物、蛋白质和脂类)预测GDM发展为T2D。我们使用Cox回归进行了一项附加分析，考虑了从基线开始的疾病发展时间。将其与回归模型进行比较，我们发现两种模型中的变化代谢物有很大程度的重叠，表明疾病发展时间的差异对重要代谢物的影响很小。虽然临床参数如FPG、2hPG和HOMA-IR在本研究中在发生T2D病例和非T2D对照组之间有显著差异，但在我们基于代谢的模型中，这些参数并没有提高预测能力。

代谢谱分析揭示了与GDM孕妇T2D的发展和进展相关的几种代谢途径和特定代谢产物。己糖是包括葡萄糖和果糖在内的所有6碳单糖的总和，是所有3个分析(基线、随访和纵向)中唯一显著增加的代谢物。在基线时，已糖和未来T2D风险之间的相关性非常显著(FDR < 0.001)，这与其他几个前瞻性队列研究一致。正如预期的那样，在2年的随访中，发展为T2D的妇女中己糖也显著增加。更重要的是，虽然后来发展为T2D的女性在基线时已经有较高的己糖水平，但在观察期间，与那些保持正常血糖的女性相比，她们的己糖水平进一步升高(图5B)。然而，己糖(可能是葡萄糖)升高并不奇怪，因为糖尿病及其严重程度是由循环中的葡萄糖水平决定的。虽然营养代谢途径之间存在着不断的相互作用，但在大多数情况下，碳水化合物代谢在产生能量方面优于蛋白质和脂肪。循环己糖的紊乱可能表明碳水化合物代谢的问题，但也可能指出AA或脂代谢的潜在问题。

据报道，BCAAs(异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)和芳香族AAs与胰岛素抵抗、T2D的未来发展和现有T2D呈正相关。在本研究中，我们发现BCAAs和酪氨酸的升高与基线时的显性糖尿病和随访时的现有T2D发生相关(图6A)。BCAAs升高的事实可能暗示肠道微生物组吸收或产生的增加，或利用/分解/降解的减少。除了BCAAs升高之外，更重要的是，AAs和T2D风险之间存在正相关，可能与AA分解代谢减弱有关。