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编译：北越城主，编辑：谢衣、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 论文ID 原名：Applications of Chromatography-Ultra High-Resolution MS for Stable Isotope-Resolved Metabolomics (SIRM) Reconstruction of Metabolic Networks 译名：色谱-超高分辨率质谱在稳定同位素解析代谢组学（SIRM）重建中的应用 期刊：Trends in Analytical Chemistry IF: 9.801 发表时间：2020.2 通讯作者：Richard M. Higashi 通讯作者单位：肯塔基大学 内容 1.前言 1.1通过稳定同位素解析代谢组学（SIRM）进行的代谢网络分析 代谢组学是对生物系统中细胞内和细胞外代谢物谱的研究，从中可以系统地了解细胞，组织或生物体中的分子生理学。因此，代谢组学在疾病诊断/药物反应的生物标志物发现和对紊乱反应的代谢途径分析中起着重要作用。 然而，由于总的代谢物水平受许多因素控制，包括合成和降解的速率，多种输入和输出途径以及包括在各部分间的交换在内的部分反应，因此基于总代谢物谱的代谢途径的重构是具有挑战性的。也就是说，代谢是耦合的化学反应的复杂网络，其转移或改变分子的亚结构，需要追踪代谢物的亚结构。为了大大减少代谢网络分析中的歧义，已开发出将稳定同位素示踪剂与代谢组学分析（例如稳定同位素解析代谢组学（SIRM））结合使用的方法，以通过结合使用MS和NMR方法最有效地来追踪代谢转化前体中的单个原子（图1）。该方法已成功应用于严格定义和揭示重编程的代谢活动，以应对从微生物系统到包括2D / 3D细胞培养在内的整个哺乳动物模型，离体的人体组织，患者来源的异种移植（PDX）小鼠和其他体内模型。这样的研究当然必须是前瞻性的，同位素标记在大型队列研究和非实验环境（例如生物的自然种群）中可能并不总是可行的。 图1代谢单元：UDP-N乙酰氨基葡萄糖UDP-N乙酰氨基葡萄糖由一系列连续和平行的代谢途径合成，产生主要的单元，包括氨基葡萄糖（G），乙酰基（A），核糖（R）和尿嘧啶嘧啶环（U）。 就其本身而言，稳定的同位素示踪并不意味着进行通量分析，尽管它极大地促进了标记代谢途径，这是必不可少的先决条件，SIRM方法以其最简单的形式允许从源头到代谢途径追踪原子，但不直接提供流量信息。相反，代谢通量分析明确地旨在通过代谢途径测量（通常是相对的）通量，为此存在许多数学方法，所有这些方法都需要一个明确的代谢模型，该模型可能需要代谢和/或同位素稳定状态，或具有更大灵活性的动态非稳态系统，其实验和计算成本要高得多。广泛的术语“ fluxomics”的使用通常使通量（速率）与示踪剂相吻合，并暗示了通量的研究。然而，通量分析本身就是一个复杂的领域，在这里我们将重点关注使用示踪剂来定义实验环境中的代谢途径。 SIRM研究最好利用NMR和MS方法的组合来定义尽可能多的代谢物中标记原子的数量（同位素异构体）和位置（同位素）。位置信息对于区分分解代谢和同化代谢中多种来源的碳和氮的途径非常有用，在同一实验中通过使用多种同位素可以大大增强位置信息。NMR在同位素选择性检测，位置同位素确定，稳健的无标准定量方面具有优势，并且是无损的。但是，它可能没有足够的灵敏度和分辨率来检测某些标记的代谢物。相比之下，MS的检测限低得多，样品量要求小，代谢物分辨率高，但具有破坏性，不易产生标签位置信息。 方案1中显示了典型的SIRM工作流程。SIRM实验的基本工作流程与非示踪剂代谢实验的基本工作流程相同，并从实验设计开始。对于SIRM，这需要考虑使用哪些示踪剂来最佳地解决所提出的最重要的假设。从假设的代谢网络模型开始，可以在数据分析中预先选择特定的代谢物和预期的同位素，以测试主要或次要假设，这通过减少针对目标代谢组学的多次测试统计问题，避免了不受限制的发现模式。与数据分析不同，数据采集本身可以根据仪器功能和主题确定所需的宽或窄质量保证（QA）和控制（QC）方面的考虑。也就是说，与检测主要假设相比，可以检测和定量更多的代谢物及其同位素同位素分布。其余数据可用于交叉验证，或用于进一步的发现和假设生成（这可能需要新的实验集，可能需要使用富含同位素的不同来源）。在其他地方已经讨论了用于评估不同代谢途径的富集前体的选择。极性（水溶性）和非极性（主要是脂质）可以使用Folch方法轻松分配。通常，应同时分析这两种化合物，因为复杂的脂质是由乙酰辅酶A和其他几种常见的极性代谢物制成的，这些代谢物是由例如乙酰氨基甲酸酯衍生的。葡萄糖或氨基酸，包括甘油（磷酸）丝氨酸，肌醇等中枢代谢的其他中间体。对给药后多个时间点采集的培养基或血液进行分析，提供了一种评估养分吸收和化合物排泄的方法，包括乳酸和丙氨酸，以及其他通常跨质膜交换的氨基酸。利用动物实验的血液，还可以通过器官间转移评估代谢干扰。化合物鉴定是基于质谱中准确的质量，裂解模式和保留时间，最好与标准品进行比较。每当可行的内标物用于定量时，例如同位素标记的化合物均不干扰实验中标记的化合物。必须遵循质量控制和质量保证的良好做法，包括空白和对照散布在样品之间，应将其随机分配。 方案1 SIRM工作流程。该工作流程显示了从实验设计到样品处理，分析数据收集和分析以及生物信息学的过程。 同样，基于NMR的识别基于化学位移，偶联模式和2D NMR分子连接性。利用13C / 15N富集，利用NMR可以进行广泛的基于旋转拓扑学的实验，以鉴定分子及其同位异构体模式。通常不可能获得所有可能的同位素的标准，但是从准确的质量增量中鉴定同位素是相对简单的。 1.2 LC-MS / MS 诸如但不限于液相色谱（LC），气相色谱（GC）或毛细管电泳（CE）等分离技术可有效地引入名义无干扰样品到MS。但是，它们各自都有局限性（参见表1）。例如，高分辨率的LC-MS方法可以分析多种代谢物。但是由于用普通的液相色谱方法仍难以分离极性和带电结构异构体，可能需要使用反相液相色谱（RPLC）和亲水相互作用液相色谱（HILIC）对样品进行两次分析，以实现合理的代谢组覆盖率；GC-MS非常适合用于分析具有高色谱分离度的氨基酸/有机酸/糖的挥发性或半挥发性衍生物，但后者需要衍生化，即使如此，极性代谢物（如磷酸己糖，核苷酸和永久带电的胆碱）仍然存在挥发性低，无法分析；CE-MS是用于分析高极性和带电代谢物的有用技术，但目前其应用受到代谢组学应用的敏感性和/或可重复性的限制。最近，与质谱仪连接的离子淌度设备已被整合到代谢组学工作流程中，尽管目前具有相对较低的质量分辨率（<< 200,000），这不适用于mSIRM，但它们具有较高的样品通量和较高的色谱分辨率。 LC-MS / MS使用不同的高分辨率分离柱（例如反相C18，C8或亲水性色谱柱，例如HILIC）通常是代谢谱分析的主要手段，尽管对更高分辨率色谱的推动越来越限制了色谱分离所能达到的质量分辨率。另外，全球性的非靶向MS / MS在SIRM研究中是不切实际的，因为除化学噪声外，由于存在标记的同位素异体及其加合物，其特征要比未标记的病例多得多。例如，根据我们典型的13C，15N，2H mSIRM实验，MS1中的88种代谢物中有超过14,500种目标分析物，每个色谱峰平均约有165种共洗脱分析物，因此MS1中需要亚ppm的分离能力，在使用任何MS / MS之前量化这些同位素。这些同位素分子不是独立的代谢产物（因此它们不是自变量），而是代表时间整合的交错生物合成/利用，对途径重建至关重要。 串联质谱通常用于提高化合物鉴定的可靠性。当需要代谢亚基中的同位素异构体分布时，建议使用串联质谱，超高分辨率（UHR）质谱（> 200,000）可大大增强串联质谱。UHR-MS在阴离子模式下与离子色谱（IC）MS兼容，被引入代谢组学研究，对带电分子（如糖酵解，戊糖磷酸途径，克雷布斯循环和己糖胺途径中发现的分子）具有出色的分离特性。阴离子IC无加合物，无流动相梯度，并且对MS的色谱峰具有极低的电喷雾离子抑制表现，这一点得到了增强。在SIRM研究中将IC与串联UHR-MS结合使用是下一个合乎逻辑且令人兴奋的新发展，下面将针对具体应用进行描述。 1.3离子色谱（IC）与超高分辨率傅里叶变换质谱（UHR-MS）结合可增强代谢网络的稳定同位素示踪 为了阐明代谢网络，在相同的（例如[13C5,15N2]-Gln）或不同的底物中（例如[13C6]-葡萄糖+ [15N2] -Gln）来扩展代谢途径的覆盖范围。此外，扩大每个样品的覆盖范围可避免样品批次的影响，有助于避免由于生物学差异而造成的数据混淆，并且标记可以对冲（但不能消除）未标记来源的污染；非SIRM实验几乎没有办法解决后者。但是，这些示踪原子之间的中子质量差（例如，对于13C和15N，Δmass= 0.006995 Da）需要UHR-MS可靠地解析它们。一种实现UHR-MS的方法是直接注入UHR-FTMS，在SIRM或多路SIRM（mSIRM）研究中，分辨力设置在200 m / z时> 200,000。但是，直接输注UHR-MS不能轻易拆分异构体，因为它们具有相同的质荷比（m / z），例如6磷酸葡萄糖（G6P）和6磷酸果糖（F6P）（m / z 259.02244）或UDP-GlcNAc和UDPGalNAc（m / z 606.07429）。这些代谢物之间的区别可能对代谢研究至关重要。另外，标记的同位素分子物种的存在可以使分子离子的数量增加一到两个数量级，而丰度通常相差一到两个数量级，这会由于过度拥挤和离子抑制而造成严重的数据分析问题。更不用说加重许多共洗脱离子的数据处理限制了。例如，在我们实验室中，典型的13C，15N，2H mSIRM实验仅对ATP就有> 450个同位素异构体，每个样品需要解析度> 14,500个同位素异构体目标分析物。 通过将IC耦合到UHR-MS，可以达到所需的分析物分辨率，这在电喷雾MS下具有足够的分辨率和灵敏度，可用于分析极性和带电的有机和无机化合物。由于洗脱液抑制剂的数十年稳步改进，它与电喷雾MS检测特别兼容，可从色谱柱洗脱液中除去流动相盐（例如用于阴离子交换的KOH），从而大大减少了电喷雾离子抑制，同时在相对梯度下呈递分析物。游离，无加合物的条件，从而提高了MS的定量限。 对于SIRM研究，中分辨率IC最适合，因为需要长时间扫描的UHR-MS1首先分析带有单个或多个示踪原子的代谢物的任何和所有同位素。一般而言，代谢组学的一个被忽视的需求是分析无机阴离子，例如硝酸根，亚硝酸根，硫酸根和磷酸根，而目前的IC实施也与极性有机代谢物的分离同时完成了这一任务。 IC-UHR-MS方法已成功应用于大量带电代谢物及其同位素异构体的分析，包括氨基酸/有机酸，谷胱甘肽，糖磷酸酯，核苷酸，无机阴离子和糖核苷酸，如前所述，目前每次进样总共有超过14,500种目标分析物。 2. MS2分析以确定位置标记 可以通过各种色谱-MS平台（包括以MS1全扫描模式运行的IC-UHR-MS）轻松确定许多富含同位素的代谢物。然而，这没有提供有关代谢产物中标记位置的信息，这限制了重建构成代谢途径的交叉或循环耦合化学反应的能力。 例如，UDP-GlcNAc包含四个有机代谢亚基，它们衍生自几个交叉的代谢途径（图1）。尿嘧啶环（图1中的U亚基）是通过Krebs循环和嘧啶合成从葡萄糖和谷氨酰胺经天冬氨酸合成的。核糖环（亚基R）可以通过磷酸戊糖磷酸途径（PPP）从葡萄糖生成。葡萄糖胺单元（亚基G）通过己糖胺生物合成途径（HBP）来自葡萄糖和谷氨酰胺。乙酰基（亚基A）可以来自多种来源，包括葡萄糖，谷氨酰胺和脂肪酸。如果不使用诸如[13C6]-葡萄糖或[13C5，15N2] -Gln的示踪剂和标记号信息，则无法重建导致UDP-GlcNAc合成的多种生化途径的活性。 通过在MS2模式下通过分解代谢产物获得有关同位素富集位置的信息并分析相关的片段化代谢亚基的同位素同位素分布，可以完成对交叉途径的严格解释。 2.1需要数据独立模式来执行MS2分析，以分析片段的同位素 数据依赖分析（DDA）和数据独立分析（DIA）是代谢组学研究中代谢物靶向和非靶向鉴定和定量的两种主要策略。尽管DDA方法可以在一次LC-MS运行中提供关于前体离子和产物离子的准确而敏感的质量信息，但它具有重现性差和MS / MS覆盖率不足的问题，因为只有那些在MS1扫描后满足定义标准的前体离子才可以选择碎片化，这在DDA方法下是随机的。与直接输注不同，每次LC-MS1扫描中每种化合物的信号强度在整个色谱峰上都不同，这可能导致选择不同的前体离子，因此运行之间的重现性较差。此外，通常选择完整MS1扫描中最丰富的离子进行碎片化，而许多相关的低丰度物质通常却无法进行碎片化。对于非SIRM研究而言，后者并不是一个严重的问题，因为可以忽略自然丰度的同位素。相比之下，对于SIRM研究，共洗脱数十种通常为低丰度的同位素，是MS / MS所追求的离子。 或者，DIA原则上可以激活所有离子物种的碎片化，而不论其丰度和m / z。这是因为对于每个循环，都将选择，分段和分析预定义m / z窗口内的所有可检测前体。但是，在宽阔的窗口中将所有前驱物离子碎片化将失去前驱物及其产物离子之间的直接联系，这使得MS2光谱的分析更加困难。然而，DIA具有片段鉴定和定量的重现性和准确性的重要优势，同时所需的采集时间比DDA短得多。 当应用于SIRM研究时，DIA能够将给定代谢物的所有同位素同位素离子碎片化，而无论其丰度如何，这对于DDA而言都是不切实际的，但对于确定代谢物中同位素标记的位置至关重要。由于必须继续采集UHR-MS1才能定量总同位素，因此非常需要同时采集UHR-MS1和MS2，尤其是在考虑mSIRM研究中的样品限制和较长的IC注入周期（每个样品60分钟）时。不幸的是，UHR-MS1数据需要相对较长的采集时间，因此每个周期中可用于MS2数据采集的时间非常有限，这极大地限制了可通过DDA分裂的离子数量。这些考虑迫使我们选择DIA-MS2来开发基于IC-UHR-MS的位置异位异构体分析方法。如目前尚无关于SIRM的这种下层方法的文献，我们在下面说明该方法的原理及其生化解释价值。 2.2 SIRM研究中具有独立于数据的测量的超高分辨率质谱 2.3数据分析与量化 分析了各个代谢物标准物获得的前体产物离子光谱，以建立内部化合物数据库。代谢组学数据库，包括人类代谢组数据库（HMDB），《京都基因与基因组百科全书》（KEGG）和METLIN以及Mass Frontier，用于帮助确定潜在片段，以帮助光谱解释。当然，这些数据库中没有一个包含众多生化产生的同位素异构体的质谱图，也没有任何暗示其位置异位异构体离子的信息。例如，仅对于还原型谷胱甘肽，必须在MS1下检测到351个2H + 13C + 15N mSIRM实验的同位素，转化为数千个MS2模式。我们的内部经验数据库已合并到TraceFinder v3.3（Thermo Scientific）中，以分配和获取目标代谢物的MS1光谱中前体离子和MS2光谱中的碎片离子的峰面积，以进行进一步定量。前体和碎片的质量精度均设置为5 ppm。 除TraceFinder之外，某些开源软件包和平台（例如Skyline，El-Maven等）也可以在进行必要的格式转换后用于数据分析。关键步骤是目测整合峰，因为单个代谢物的同位素同位素分子离子簇可以延伸数百m/z，从而可能干扰其中的某些峰。非常关键的是，如前所述，对同位素同位素的峰面积进行了自然丰度的校正，从而获得了富含同位素的实验强度。可以使用其他自然丰度校正算法。但是，对于需要超高分辨率的多重SIRM实验，不可能提供精确的分析解决方案，需要同时针对至少三种同位素进行验证的迭代算法。 2.4用于代谢途径重建的MS1和MS2代谢物的同位素富集分布 糖酵解，克雷布斯循环，PPP和核苷酸代谢产生的主要代谢物的同位素富集分布可以从所追踪样品的[13C6]-葡萄糖和[13C5,15N2] -Gln的UHR-MS1和MS2光谱中获得。在这里，我们显示了糖酵解和糖异生产物的一个例子来说明原理。糖酵解通过一系列磷酸化的中间代谢产物将葡萄糖转化为丙酮酸，而糖异生通常通过肝脏和肾脏通过PEP将3-碳代谢产物转化为葡萄糖（图2）。这些器官产生葡萄糖以维持组织稳态。但是，许多其他组织也是糖异生的，只是它们不表达磷酸酶，因此将糖异生产物保留在细胞中用于合成代谢目的，例如G6P的糖原合成，G6P或F6P的PRPP合成和NADPH生成（G6P的合成）通过戊糖磷酸途径，以及通过六胺途径合成葡萄糖胺（来自F6P）。 图2.糖酵解和糖异生中的13C同位素异构体。13C原子从[13C6] -Glc或[13C5,15N2] -Gln追溯到糖酵解代谢物中。 IC色谱柱无法从其他中性己糖中分离出葡萄糖，这些中性己糖在空体积后立即作为一个峰洗脱。但是，带负电荷的磷酸化中间体可通过IC分离，异丁酸2磷酸甘油酯（2PG）和3磷酸甘油酯（3PG）对除外，它们具有相似的保留时间。我们能够使用MS1数据来量化所有其他糖酵解产物的同位素同位素分布，即葡萄糖6-磷酸（G6P），果糖6-磷酸（F6P），果糖1,6-6-双磷酸（F1,6P），1,3 -双磷酸葡萄糖酸酯（1,3BPG），磷酸烯醇丙酮酸（PEP），丙酮酸和乳酸。 在[13C6] -Glc追踪的A549球状体中（图3A），这些产物以其13C标记的均匀同位素异构体占主导地位，表明活性糖酵解。亚硒酸盐处理改变了G6P，F6P，1,3-BPG，丙酮酸和乳酸的这些同位素分布，这表明参与其代谢的酶的活性发生了变化，包括己糖激酶（HK），磷酸葡萄糖异构酶（PGI），磷酸果糖激酶（PFK）。 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH），丙酮酸激酶和/或乳酸脱氢酶。此外，所有糖酵解产物的13C加扰同位素均很低，包括13C2-5-F6P（c）-F1,6BP（d）和-G6P（a）（图3A）。这些代谢物的MS2片段的13C标记模式与它们通过转酮醇酶（TK）和/或转醛醇酶（TA）活性从PPP衍生而来的一致，因为磷酸戊糖途径中间体（包括S7P，E4P）可通过IC拆分。 图3.通过FTMS1和MS2进行的13C同位素同位素分析显示，糖酵解和糖异生途径对A549细胞中的亚硒酸盐或BEAS-2B细胞中的亚砷酸盐转化的响应。 A.A549细胞，B BEAS-2B细胞 G6P的13C3-C1,4-6片段（b）和F1,6BP的13C2-C1-3片段（e）表明存在母体13C4-C3,4,5,6和/或13C2-C1，2种（图3A），分别是TA和TK反应的产物。亚硒酸盐阻止了这些13C扰乱的糖磷酸酯产物的产生，这反映了其对A549球体中PPP活性的抑制作用。 现在转到在[13C5,15N2] -Gln追踪的BEAS-2B细胞上进行的多重SIRM实验，在糖酵解中间体中很低水平的13C富集是明显的（图3B），这表明这些细胞中糖异生的水平非常低。在GAPDH步骤之后，亚砷酸盐显着耗尽了未标记的中间体，这可能是由于该途径及其后酶的阻断所致。从13C1乳酸的消耗中可以证明，苹果酸酶（ME）也可能受到抑制。但是，基于PEP和F1,6BP的13C标记模式，亚砷酸盐似乎并未影响糖异生。 结论 1.对于路径分析和通量分析，示踪法都是必不可少的； 2.迄今为止，几乎没有描述将高分辨率串联质谱与色谱法相结合的工作流程，部分是由于硬件和软件的限制，而对于mSIRM尚未见报道； 3.我们已经证明了用于哺乳动物细胞中mSIRM研究的定量IC-UHR-MS1 / DI-MS2方法，以分析具有生物合成来源的代谢物亚结构； 4. 通过分析人肺癌细胞中的糖酵解和糖异生来说明，结合使用ICUHRMS1 / DI-MS2方法既省时又节省样品，同时通过MS1和位置标记提供代谢物的所需总标记分布单次注射通过DI-MS2代谢物亚基。 原文网址：https://linkinghub./retrieve/pii/S0165993619303978 |
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