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编译：胡亚楠，编辑：Emma、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 慢性社会应激能够特异性下调伏隔核（NAc）中内皮紧密连接蛋白，从而增加血脑屏障（BBB）的通透性，从而促进抑郁样行为的形成。但是，NAc中内皮紧密连接蛋白下调的分子机制并不明确。这篇研究通过使用比较代谢组分析的方法分析社会挫折应激小鼠的NAc、前额叶皮层和海马，鉴定调节BBB通透性的分子机制。结果证明，cAMP在NAc中特异性降低，并且其降低量与社会逃避程度成正比；增加NAc中cAMP的含量能够提高BBB的完成性并缓解抑郁样行为。进一步研究发现，cAMP在NAc的神经元中特异性地降低，而在星形胶质细胞或小胶质细胞中没有降低。RNA测序分析结果显示，腺苷环酶5（Adcy5）是一种负责从ATP合成cAMP的酶，主要在NAC中表达，并且完全存在于神经元中。通过敲除NAc中的Adcy5，神经元中内源性cAMP的合成调节了对社会压力的敏感性。此外，NAc中Adcy5合成的缺陷能够降低reelin蛋白的表达，在NAc中注射外源性reelin蛋白能够促进BBB的完整性同时缓解抑郁样行为。因此，NAc中神经元合成的cAMP的合成含量可以作为社会应激诱导的脑血管病理性变化的生物学机制。 论文ID 实验设计 实验结果 1. 社会应激的脆弱性与NAc中的cAMP减少有关 在NAc中，紧密结蛋白Cldn5的表达减少，显示出改变BBB的完整性，从而促进抑郁症样的行为；然而，Cldn5表达和BBB完整性在前额皮层（PFC）和海马（Hip.）中保持不变。根据这一发现，在社交互动（SI）测试后24小时，我们观察到易感小鼠的血浆和NAc中的 IL-6 水平持续增加并进一步验证了Cldn5在NAc中表达降低。尽管血浆中IL-1和TNF-α表达略有增加，但大脑中的IL-1和TNF-α水平没有差异。为了描述在NAc中BBB完整性的特定区域分解的分子机制，我们对三个候选位点（NAc、PFC和Hip.）进行了比较代谢分析，涉及无应激对照小鼠（CTRL）、经过10天慢性社会挫折应激（CSDS）的易感（SS）和弹性（RES）小鼠后MDD功能受损（图1A-1D）。代谢分析可用于发现心血管疾病、血脂异常、癌症和阿尔茨海默病等疾病的发病机制涉及的生物标志物。在这里，GC-MS和LC-MS/MS共检测到255种内源代谢物。图1E显示，与CTRL和RES小鼠相比，SS小鼠的NSC中差异代谢物显著不同，而在PFC或海马体中这些代谢物没有显著差异。图1F是一个热图，显示这些代谢物的浓度与SI比率的相关性。值得注意的是，SS小鼠的cAMP水平显著降低（图1G），并且与社会逃避程度呈正相关（图1H）。使用基于ELISA的方法获得类似的数据（图1I）。此外，NAc中的cAMP浓度高于PFC或海马区。总之，这些结果表明，在NAc中，cAMP的显著变化可能是抑郁症样行为背后的基础。 图1.社会应激的脆弱性与NAc中的cAMP减少有关 （A）慢性社会挫折应激CSDS程序的示意图.（B）根据SI比率，将压力小鼠分为易感（SS）和弹性（RES）表型;（C）SI 测试的时间热图.（D）TST 中不可控时间的量化.（E）热图显示在 NAc 中不同代谢物的强度.（F）与SI比率相关的代谢物水平.（G）在 NAc、PFC 和尾部的 cAMP 级别.（H）在 NAc 中与SI比率相关的CAMP 水平.（I）在 NAc 中与SI比率相关的CAMP 水平（由 ELISA 测量）. 2. 补充 cAMP改善血脑屏障和抑郁样行为 为了测试补充cAMP是否能改善抑郁行为，我们检查了甲糖胺环状腺苷（M-cAMP）预处理的效果（图2A-2E）。M-cAMP是一种用于心血管治疗的临床药物，可轻松穿过细胞膜。为了评估每日腹腔注射M-cAMP 治疗的动力学，我们在单次剂量10 mg/kg M-cAMP后量化了血浆中cAMP的水平及在大脑的分布。结果验证了注射后6小时cAMP水平在循环和NAc中急剧增加，但在12和24小时无差异（图2F-2G）。在社会互动测试中，M-cAMP预处理小鼠表现出较高的SI比率（图2B），并且比10天社会挫折应激后的对照组小鼠更容易患抑郁症（图2C，P=0.0033）。在TST和FST中，M-cAMP预处理显著缩短了固定时间（图2D-2E），表明cAMP具有类抑郁作用。BBB泄漏与NAc中特定级别的降低之间的空间重叠意味着两者的关联，但不一定是因果关系。为了检查M-cAMP预处理是否影响了NAc的BBB渗透性，我们通过Evans Blue（EB）染色测定BBB的渗透性和CD31的免疫荧光共定位来评估Cdn5表达。使用M-cAMP预处理减轻了Cldn5表达减少（图2H-2I），M-cAMP预处理小鼠在NAc中未表现出EB的明显渗透（图2J）。 为了进一步确认在NAc中cAMP对抑郁行为的影响，我们对易感小鼠的NAc内定向注射M-cAMP或盐水（图2K）。单次在NAc内注射M-cAMP在一周内逐渐改善了社会逃避行为（图2L），并显著缩短了TST和FST测定中的不稳定时间（图2M-2N）。这些结果支持了在NAc中补充cAMP促进BBB完整性并诱导抗抑郁样效果的假设。 图2. cAMP的补充改善血脑屏障和抑郁样行为 （A）CSDS程序和M-cAMP治疗的示意图，在社会挫折前每天2小时进行一次注射.（B）单个SI比率值.（C）社会逃避与M-cAMP治疗之间的相关性.（D）TST和 FST（E）中不可控时间的量化,等离子体（F）和NAc（G）cAMP水平.（H）Cldn5的量化表达，Cldn5+面积/CD31+区域的比率.（I）代表在血管中使用CD31和Cldn5.（J）CSDS 程序和M-cAMP处理的示意图.（K）使用EB蓝色染料评估BBB渗透性.（L）不同天数的单个SI比率值.（M）TST和 FST（N）中不可控时间的量化. 3. 在压力敏感小鼠的NAC神经元中，cAMP明显减少 cAMP被认为能促进体外内皮细胞紧密结的功能。作为第二信使，cAMP的合成和功能在细胞内受到限制。为了确定血管中的cAMP是否减少，从而调节Cldn5的调节，我们接下来使用脑毛细管提取方法丰富了NAc的血管。毛细血管提取后，血管部分在底部形成颗粒，髓鞘碎片漂浮在表面，两者分别收集，以测量cAMP浓度。出人意料的是，与对照组和RES小鼠相比，SS小鼠的NAc血管中的cAMP水平没有差异（图3A）。然而，SS小鼠髓鞘中的cAMP水平显著衰减，NAc的髓鞘中cAMP水平与社会逃避程度显著相关（图3B）。我们进行了免疫-同化分析进一步确定调解cAMP递减的细胞类型。免疫染色显示，cAMP与神经元精确结合，在NAc的神经元中明显减少，但在星形胶质细胞或小胶质细胞中没有减少（图3C-3E）。 cAMP由ATP从位于血浆膜内侧的腺苷环酶合成，通过磷酸二酯酶降解为AMP。随着cAMP的减少，代谢分析还显示ATP累积，而AMP在SS小鼠的NAc中是恒定的，表明腺苷环酶的活性在NAc中受到干扰。RNA测序数据显示，在10个亚型中，NAc区域主要表达腺苷环酶5（Adcy5）（图3F）。此外，小鼠神经系统的单细胞RNA测序绘制出Adcy5主要在NAc的中等脊柱神经元中表达。腺苷环酶通过与Gsα耦合激活，特别是位于非脂筏区域的Gsα，在那里激活腺苷环酶更为简单。接下来，我们探索了Adcy5和Gsα在脂质筏区和非筏子区域的蛋白质表达，使用浮子作为神经元特异性脂筏标记物。在脂筏或非筏子区域未观察到Adcy5的蛋白质表达差异，在SS小鼠的非脂筏区域，Gsα表达明显减弱，调解Adcy5在NAc中将ATP转换为cAMP的能力降低（图3G-3H）。 综合起来，这些结果表明，SS小鼠的NAc中减小的cAMP发生在神经元中，并且通过从脂质筏到非筏子的较少Gsα易位进行调解。 图3. cAMP在应激易感小鼠的伏隔核神经元显著降低在NAc中血管碎片 （A）和髓鞘碎片（B）中的cAMP水平.（C）将NAc与β3-tubulin（神经元）、GFAP（星形胶质细胞）和Iba1（小胶质细胞）共同染色,染色强度被量化（D），和共定位分析（E）.（F）小鼠NAc中不同构型腺苷环酶的mRNA表达.Adcy5和Gsα 在非脂筏（G）和脂质筏区（H）中的表达. 4. 在NAc中神经元cAMP合成的内源性调制后的行为变化 为了进一步确认cAMP在社会压力诱发抑郁行为中的因果作用，我们通过条件基因敲除Adcy5，以调节体内NAc中神经元的cAMP浓度。一种多氧环素-可致性腺相关病毒（AAV 2/9血清型）（AAV 2/9血清型）针对编码Adcy5的shRNA转录本，允许在NAc中可逆的调节cAMP。我们确认了Adcy5 mRNA和蛋白质的降低，以及NAc中较低的cAMP水平，未发现其他亚型的腺苷环酶。经过2周的恢复，随后2周的多氧环素治疗，微防御，一个低于第二位的社会挫败水平，被用来调查在NAc中还原性cAMP的易感性作用（图4A）。我们观察到，仅是cAMP的减少对行为没有影响，但是，cAMP的减少结合暴露于微防御明显诱发了社会逃避行为和感知缺乏（图4B-4C）。值得注意的是，在随后5天内提取多氧环素，恢复Adcy5表达，显著逆转了抑郁行为（图4D-4F）。另一组进行补充的小鼠也表现出对防御的无法感知（图4G-4L）。总之，这些结果表明，在NAc的神经元中cAMP缺失增强了小鼠的易激性。 图4. 在NAc中神经元cAMP合成的内源性调制后的行为变化 （A）Adcy5救援实验的示意图.（B）第29天的个别SI比率值.（C）第30天TST中不可控时间的量化.（D）第38天的单个SI比率值.（E）第39天TST中移动时间的量化.（F）第41天对蔗糖偏好的评估.（G）cAMP补充实验的示意图表示.（H）第29天的单个SI比率值.（I）第30天TST中不动时间的量化.（J）38天的单个SI比率值.（K）第39天TST中移动时间的量化.（L）第41天蔗糖偏好评估. 5. Reelin介导了cAMP的抗抑郁样作用 RNA测序分析表明，与10天CSDS后CTRL小鼠相比，SS小鼠的细胞外基质（ECM）受体相互作用通路明显受到干扰。在这一途径中，作为基膜主要结构成分的胶原蛋白IV（Col IV）的基因表达显著减少。使用CD31和传输电子显微镜对Col IV进行共核化表明，BBB的基底膜（不仅是内皮紧密连结蛋白）在NAc中受到损害，同时补充cAMP提高了NAc中基膜的完整性。Reelin（Reln）是由GABAergic受体表达分泌的糖蛋白，已被证明在细胞外基质网络中发挥着至关重要的作用，通过突触细胞足端附着到血管中促进BBB的发展。值得注意的是，根据Allen大脑图集，Reelin在空间上与Adcy5相吻合。我们进一步研究了NAc中的cAMP水平是否会影响Reelin信号。有趣的是，我们发现，在AAV-shRNA-Adcy5小鼠中，Reelin的mRNA和蛋白质表达比AAV-shRNA小鼠低得多（图5A-5B），这表明Reelin在cAMP缺乏时调解易感性的关键作用。据报道，外周IL-6能够穿透SS小鼠的NAc软组织。我们同时发现，重组生物素YL-6在有压力的AV-shRNA-Adcy5小鼠的NAc中可检测到，但在压力不大的AV-shRNA小鼠中没有检测到（图5C）。值得注意的是，在NAc内向AAV-shRNA-Adcy5小鼠注射Reelin，足以改善SI测试中的社会逃避行为（图5D-5F）和蔗糖偏好测试中的血管节行为（图5G），以及在NAC中IL-6的渗透作用（图5H）。我们还评估了急性（5d）和慢性（35d）氟西汀治疗对SS小鼠NAc中Reelin信号的影响。慢性氟西汀治疗（图5J），但不是急性氟西汀治疗（图5I）足以恢复NAc中的Reelin蛋白表达。 图5. Reelin介导cAMP抗抑郁样的作用 AAV-shRNA和AV-shRNA-Adcy5小鼠的NAc中mRNA（A）和蛋白质（B）表达.（C）在NAc中生物基化IL-6和CD31的合生化.（D）Reelin补充实验的示意图表示.（E）小鼠的单个SI比率值.（F）SI测试的时间热图.（G）蔗糖偏好评估.（H）在NAc中IL-6和CD31的共定位.（I）急性氟西汀治疗后Reelin蛋白表达.（J）慢性氟西汀治疗后Reelin蛋白表达. 结论 如果需要原文pdf，请扫描以下二维码，加助理获取
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