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编译：Prolemon，编辑：Emma、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 2019年冠状病毒病（COVID-19），亦称新型冠状病毒肺炎（Novelcoronavirus pneumonia，NCP）简称新冠肺炎，是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的急性传染病，严重威胁着全球公共卫生事业。自疫情大流行3个月内，全球就已有超过200万人被感染，其中超过15万人死亡。目前，新冠肺炎相关研究多集中在描述患者的流行病学和临床特征：新冠肺炎患者中，80%的患者预后良好仅表现出轻微症状，一般可在接受甚至不接受常规治疗后就会康复，因此被归为轻度或中度COVID-19。然而，约20%的患者会患有呼吸窘迫，需要立即进行有氧治疗或其他包括机械通气在内的住院干预，这些患者在临床上被划分为重度或危重患者，需要立即进入专业的重症监护，否则可能迅速死亡。因此，开发新方法在早期评估哪些患病人群将可能成为临床危重症患者显得尤为重要。 论文ID 实验设计 图1 实验设计与流程 通过对健康对照组、疑似但实为普通流感组、新冠感染轻症组、新冠感染重症组4组受试者血清进行蛋白质组和代谢组检测，鉴定出了894种蛋白质和941种代谢物，发现新冠肺炎重症组相较其它组，鉴定出了93种特有的蛋白表达和204个特征性改变的代谢分子，提示与患者体内的巨噬细胞、补体系统、血小板脱颗粒代谢通路有关。基于多组学深度分析，建立了疾病分类器，通过独立的验证队列和测试队列证明该分类器可在新冠患者患病早期区分出重症病例。 实验结果 1. 新冠肺炎患者蛋白质组和代谢组学特征 我们使用了稳定同位素标记的蛋白质组学策略和超高效液相色谱/串联质谱(UPLC-MS/MS)非靶向代谢组学方法分析了健康对照组（n=28）、疑似但是核酸检测阴性实为普通流感组（n=25）、新冠感染轻症组（n=37）、新冠感染重症组（n=28）4组血清样本，共鉴定和量化了894个蛋白和941个代谢物(包括36种药物及其代谢物)。新冠肺炎重症组相较其它组，鉴定出了93种特有的蛋白表达和204个特征性改变的代谢分子，主要富集在巨噬细胞、补体系统、血小板脱颗粒3条代谢通路。 图2 重症COVID-19患者关键蛋白质和代谢物特征 SARS-CoV-2可能通过肺泡巨噬细胞ACE2受体,导致细胞因子IL-6和TNF-a等分泌增加，诱发SAP、CRP,SAA1, SAA2,和C6等急性期蛋白发生显著改变。 2. 对重症COVID-19患者进行分类 尽管基于核酸的方法可以在早期有效地诊断COVID-19，但在出现严重症状前识别重症患者对降低死亡率同样至关重要。在本研究中，我们发现，使用基于22种血清蛋白和7种代谢物表达水平的机器学习模型，可以根据代谢物和蛋白的分子特征对重症病例进行分类(图3A和3B)。在训练集(C1)中，我们获得了93.5%的总体准确率。两名患者的分类与临床诊断不匹配，其中患者XG3为非重症组中年龄最大的患者，反映了我们临床队列的复杂性。在(C1)训练集中, 我们根据收集的患者血清样本正确识别了5个重症患者，值得注意的是，血清样本采集后1到4天他们才被临床诊断为重症患者,这表明患者的血清蛋白质和代谢物特征在采样时已经提示其日后会发展为重症患者，即使采样时患者重症相关临床症状还没有开始出现。在我们的分类器中使用的蛋白和代谢物(图3A)包含几个已知的病毒感染的生物标记物，如血清淀粉样蛋白A-2 (SAA2)、SAA1和CRP，它们已经被经验性地用于监测COVID-19的严重程度。我们的研究表明，在蛋白质和代谢物水平上更多的特征分子变化可以用来建立诊断模型进行鉴定，在新诊断病例中如果对这些蛋白进行更广泛的检测，以确定哪些COVID-19患者可能会发展为重症病例，可能会给预后带来好处。 图3 通过患者蛋白质组和代谢组特征构建机器学习区分重症和非重症COVID-19 (A)根据随机森林的平均准确度下降排序的前22个蛋白质和7个代谢物。(B)分类器中的蛋白网络图。红点代表上调，绿点代表下调，白节点表示在我们的数据集中没有检测到的分子。(C)基于训练队列(C1)的 随机森林受试者工作特征曲线（ROC）。(D)模型在10例COVID-19患者的试验队列(C2)中的表现。(E) 模型在19例COVID-19患者的试验队列(C3)中的表现。用红色标记了患者是在血清测试之前被诊断为重症患者。 3.血清分子病理改变揭示SARS-CoV-2感染潜在致病机理 巨噬细胞过程与脂质代谢密切相关。蛋白质组表明APOA1、APOA2、APOH、APOL1、APOD和APOM等多种载脂蛋白呈现下调趋势。代谢组学同时也检测到了异常脂质代谢产物如21-羟基孕烯酮的增加。此外，犬尿氨酸（色氨酸代谢中间产物）通路显著激活，提示SARS-CoV-2可能是通过影响色氨酸对巨噬细胞功能进行调节。在重症患者中，超过100种脂质被下调。数据显示，非重症和重症COVID-19患者的鞘脂也均有所下降。COVID-19患者中，胆碱及其衍生物下调，特别是在重症患者中，而磷脂酰胆碱(PC)中间体磷脂酰胆碱上调，这可能是由于活化的巨噬细胞介导的免疫反应。 图4 (A)富集在巨噬细胞、补体系统、血小板脱颗粒3条代谢通路上的50个蛋白质的热图；（B）非重度和重度新冠患者有显著差异表达水平变化的6个蛋白。 包括SAA1、SAA2、SAA4、CRP、α-1-抗胰凝乳蛋白酶(SERPINA3)和血清淀粉样蛋白p组分(SAP/APCS)在内的10种活化的急性期蛋白(APPs)参与了对SARS-CoV-2感染早期免疫反应阶段。（图4）此外，补体系统作为急性期反应的主要贡献者，在感染早期对入侵病原体的清除起着至关重要的作用。补体6 (C6)和补体因子B (CFB)以及另外两个补体系统的调节因子P因子(CFP)和羧肽酶N催化链(CPN1)发生显著性改变。此外，我们还观察到了甘露糖及其衍生物在重症患者中的积累。在补体系统中，甘露糖与凝集素结合导致C2和C4的分裂，进而形成C3转化酶，从而促进补体的活化。 在SARS-CoV-2感染患者中，17个参与血小板脱颗粒的蛋白中有15个下调，这可能与该患者队列中观察到的血小板减少有关。低血小板计数也被报道与COVID-19严重和死亡率相关。在重症患者中，两个最有趣的下调蛋白是血小板表达趋化因子原血小板碱性蛋白(PPBP;亦称巨噬细胞源性生长因子和血小板因子4 (PF4)。PF4通过与主要病毒包膜糖蛋白p120的相互作用，被认为是一种广谱HIV-1抑制剂。此外，在对SARS患者血清的蛋白质组学研究中，PF4降低与不良预后相关，这与我们对COVID-19的研究结果一致。大多数肠嗜铬细胞衍生的血清素(5-羟色胺，5-HT)被运输到血小板中储存和释放。血清素水平随着COVID-19严重程度的增加而降低(图5B)，血小板计数也降低。与健康组相比，COVID-19非重症患者血清素下降2.07倍(p = 1.86e-04)，重症患者血清素下降3.31倍(p = 9.07e-07)。 图5 (A) 10大类80种代谢产物的热图。(B) 非重度和重度新冠患者8种有显著差异的代谢产物的表达水平变化 与健康对照组相比，COVID-19患者血清中100余种代谢物、氨基酸及其衍生物明显下降，而非COVID-19患者血清中氨基酸及其衍生物水平未发生变化甚至升高。在这些代谢物中富集的是10个涉及精氨酸代谢的代谢物，包括谷氨酸、精氨酸、N-(l-精氨酸)-琥珀酸、瓜氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺、2-氧戊二酸、N-乙酰- l-谷氨酸、尿素和富马酸。此外，非重症COVID-19患者血清中精氨酸、不对称二甲基精氨酸、对称二甲基精氨酸、同精氨酸、纳乙酰精氨酸等精氨酸衍生物也明显下降，提示肝功能障碍。 讨论 研究队列中重症患者的中位年龄比非重症患者大12岁左右，重症患者还表现出较高BMI和更高比例的如糖尿病等并发症，因此无法准确定义年龄或并发症等混杂因素对数据解释的影响。其次，本研究中的蛋白质组和代谢组分析不是绝对定量的，如果该模型要应用于临床，需要使用标准肽和代谢物对这些分子进行更严格的定量和广泛的验证，也必须评估包括中药在内的药物对蛋白质组学/代谢组学特征的影响。此外，从不同的时间点收集的血清样本，可用于探索疾病进展过程中的分子动力学。但是，该研究样本量比较小，未来也需要对更多时间点更多人数的新冠患者样本研究进行深入的分析。 评论 本研究应用蛋白质组学和代谢组学技术通过检测不同临床分型的COVID-19患者及重症患者动态演变过程中的血清样本，寻找出了疾病相关特征性分子变化并以此成功建立了机器学习模型：可在COVID-19患者疾病早期就鉴别出重症病例。本研究展示了SARS-CoV-2感染所诱导的血液分子变化的全景图，为COVID-19的诊断和治疗提供了新的思路和线索。 |
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