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编译：谢婉秋，编辑：Emma、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 OTX2是促进组3髓母细胞瘤（3MB）生长的致癌基因，而OTX2抑制神经分化的机制目前还不清楚。本研究中作者进行了广泛的多组学分析，确定了控制3MB细胞命运的OTX2调控网络。OTX2的沉默调节抑制性染色质，降低PRC2复合体基因水平，使PAX3和PAX6等神经发育相关转录因子表达增加。PAX3和PAX6在3MB患者中的表达明显降低，并与生存期降低有关。3MB肿瘤球体的单细胞RNA测序显示，在原发肿瘤中观察到未分化的祖细胞相关基因的表达。作者还确认了mTORC1信号是OTX2-PAX3的下游效应因子，揭示了蛋白质合成途径在调节3MB发病机制中的作用。 论文ID 实验设计 实验结果 脑瘤是最致命的儿童癌症，MB是最常见的儿童原发性恶性脑瘤，MB死亡率为33%，幸存者因放化疗留下神经认知后遗症而无法独立生活。 MB分为四个程度不同的亚组：WNT、SonicHedgehog(SHH)、组3(3MB)和组4(4MB)，并进一步细分为多个亚型，分别显示出不同的临床结果。3MB肿瘤占MB病例的四分之一，预后最差，并且高度转移，超过50%的患者在诊断时表现出肿瘤细胞扩散。3MB被认为起源于小脑发育早期短暂存在的干细胞或/祖细胞群体，但具体分子机制还不得而知。靶向治疗目前正在进行临床试验，对干/祖细胞特征的未分化MB细胞进行进一步地分子鉴定有助于尽快开发出对神经系统毒性较小的药物。 正齿同源异型盒2(orthodenticlehomobox 2，OTX2)是一种同源结构域转录因子，在神经系统构型、细胞命运和定向分化中起关键作用，在许多脑和眼损伤中，发现了OTX2突变。在3MB和4MB中，发现了80%以上的OTX2表达增加，并发现OTX2在3MB中能够促进肿瘤生长。研究发现OTX2通过与活性增强子元件结合以及维持组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)来调节G3MB染色质结构。 许多研究在3MB中阐述了OTX2在控制细胞命运中的关键作用，OTX2沉默导致轴突相关基因表达的增加，这表明OTX2抑制细胞分化，同时保持3MB组细胞处于原始的干/祖细胞状态。然而大多数已鉴定的轴突诱导基因被发现是OTX2的间接靶点，OTX2抑制3MB细胞分化的机制尚不清楚。作者试图确定OTX2的互作蛋白，并进一步探究OTX2是如何调控与细胞命运相关的基因的。考虑到3MB的干细胞/祖细胞起源，H3K27me3水平的破坏，以及在这些肿瘤的一个亚群中存在H3K27去甲基化酶的失活突变，于是假设OTX2在3MB组中在抑制分化基因全局特征方面起着关键作用。 在这项研究中，OTX2广泛限制了对神经元分化至关重要的转录因子的表达，包括PAX基因家族的成员。PAX基因在神经系统(包括小脑)的发育过程中起着重要作用，然而它们对3MB进展的具体影响从未被研究过。在3MB组患者样本中，PAX3和PAX6在表观遗传学上是沉默的，是OTX2的直接靶点。PAX3和PAX6的功能性增强(GOF)在体外均导致肿瘤球体形成和SOX2水平降低，以及3MB基因信号的调节，然而，只有PAX3过表达使mTORC1信号减少，同时增加了存活率。本研究中作者定义了一个OTX2-PAX3基因调控网络(GRN)，它通过mTORC1信号在高度侵袭性的3MB中控制细胞命运。 1. OTX2调节3MB转录因子的沉默 为了进一步研究OTX2在调节染色质结构中的作用，绘制了在干细胞富集的D283组3MB肿瘤球体中OTX2沉默后，激活(H3K4me3)和抑制性(H3K27me3)组蛋白修饰的全基因组变化图(图1a)。在OTX2沉默后，有8444个蛋白编码基因在H3K4me3上发生了显著变化，2001个基因在H3K27me3上发生了显著变化，564个基因在这两个组蛋白上都出现了变化(图1b、c)。在H3K4me3发生变化的基因中，90%的基因在激活组蛋白标记中显著增加，而在H3K27me3改变的基因中的68%的基因在抑制组蛋白标记中显著丢失(图1d)。这些发现表明，在3MB中，OTX2沉默后基因表达下调。 在中枢神经系统发育过程中，转铁蛋白在神经元的特化、分化和自我更新中起着关键作用。因此确定OTX2下游的转录因子，以便研究以OTX2为中心的基因调控网络更加有意义。在OTX2沉默后，在419个TFs中发现了H3K4me3的显著变化，在144个TFs中发现了H3K27me3的变化，42个TFs在这两个修饰中都发生了显著变化(图1c)。与蛋白编码基因相比，TF失去抑制性组蛋白修饰的比例更大(图1d)，这表明在3MB肿瘤球体中OTX2具有沉默TFs的表达的作用。这些转录因子包括大量属于FOX、HOX、POU、PAX、SMAD和SOX家族的基因(补充数据1)。PAX基因家族成员PAX3、PAX5、PAX6、PAX7和PAX9均表现出H3K27me3的显著缺失，而PAX6同时表现出H3K4me3的显著增加(表1)。PAX家族的TF对神经系统发育至关重要，而它们在第3MB发病机制中的功能作用尚未被探讨。因此集中对PAX基因进行进一步的研究。 图1 PAX3和PAX6在3MB中表达减少 a.在3MB肿瘤球体中鉴定OTX2靶基因的流程图。b.用siRNA转染D283肿瘤球24h。c.D283肿瘤球内OTX2沉默后，H3K4me3(N=8444个蛋白质编码基因，N=419个TF)、H3K27me3(N=2001个蛋白质编码基因，N=144个TF)和H3K4me3/H3K27me3(N=564个蛋白质编码基因，N=42个TF)发生显著改变的蛋白编码基因和转录因子(TF)的数量。d.蛋白编码基因和TF的比例，分别有H3K4me3和H3K27me3修饰的比增益或比丢失。e.PAX3(上)和PAX6(下)在四个髓母细胞瘤亚组中的表达分析显示，在3MB中PAX3和PAX6的表达较低。 2. PAX3、PAX6在3MB中低表达 OTX2沉默后的763个分组的患者样本中，显示组蛋白标记差异的PAX基因的转录本水平。与WNT和SHHMB肿瘤相比，3MB和4MB的Pax3和PAX6显著降低，而PAX5、PAX7和PAX9在4个亚组之间无显著差异(图1e)。在总体预后最好的WNTMB肿瘤中，PAX3的表达显著增加。这与在3MB和4MB中观察到的非常高的OTX2水平形成了鲜明对比。值得注意的是，PAX3和PAX6的表达与MYC没有明显的相关性，MYC在3MB组肿瘤中高表达(补充图2)。然而，从患者样本单细胞RNA测序(ScRNAseq)数据11对3MB组簇的分析表明，虽然OTX2存在于3MB组的大多数细胞中，但表现出广泛的表达(图2a，b)。而在此数据集中没有检测到PAX3，而PAX6表达水平非常低(图2b)，而OTX2在第9、3和8簇中的表达较高(图2b)。簇9和簇3为循环细胞簇，而簇8由表达光感受器基因的肿瘤细胞组成，如CRX和RCVRN。这与先前发现OTX2的表达与细胞周期以及光感受器基因相一致。 PAX3和PAX6的预后相关性分析显示，其高表达与显著改善预后相关(图2c)。为了支持这些发现，3MB石蜡包埋(FFPE)样本的PAX3和PAX6水平也较低(图2d)，以及蛋白质组学分析(图2e)的患者队列中的PAX3和PAX6水平较低，而OTX2在3MB肿瘤中水平非常高。在转录数据中观察到，PAX3水平在WNT MB肿瘤中最高，而PAX6水平在SHHMB亚组中升高(图2e)。小脑组织单细胞转录组测序分析显示，OTX2和Pax3的表达模式是互斥的，这表明一定比例的OTX2+和Pax3+细胞具有不同的发育起源。 OTX2和PAX6的表达主要在Atoh1(图3a)特异表达的颗粒神经元/颗粒神经元前体细胞中，而PAX3主要表达在祖细胞中，其中一些组细胞还表达Ptf1a(早期心室区细胞的标志)(图3a)。因此，正常的发育表达模式与在MB中观察到的有所不同。总之，作者的表达和生存分析表明，在3MB和4MB中，PAX3和PAX6可能与分化程度更高、致瘤性更低的表型有关。 图2 PAX3和PAX6蛋白水平在3MB中较低，这两个基因的低表达与患者存活率降低有关 a.来自两个3MB组患者样本的9个转录上不同的细胞群体。b. PAX6(左)和OTX2(右)在来自N=2组3MB患者样本的9个转录不同的细胞群体中的表达，点图揭示了PAX6和OTX2的平均表达。箭头表示簇9中PAX6的最低表达。在此数据集中未检测到PAX3。c.在N=612MB患者样本中，PAX3和PAX6的低表达与患者总存活率显著降低有关。采用对数秩法测定P值。d.4种MB亚组FFPE切片PAX3和PAX6染色的三维图像。e.蛋白质组学分析表明在3MB组中PAX3(N=27例患者样本)和PAX6(N=45名患者样本)低表达。 3. OTX2抑制3MB组PAX3和PAX6的表达 在OTX2沉默后，PAX3和PAX6基因调控元件上大量H3K27me3的丢失，表明PAX3和PAX6的表达受到OTX2的限制。为了确定OTX2是否直接调节PAX3和PAX6的表达，我们对D283肿瘤球体进行了OTX2染色质免疫沉淀(CHIP)测序。对于D283肿瘤球体，原位观察到OTX2在转录起始点(TSS)和/或上/下游基因调节区PAX3和PAX6上富集(图3b)。这些OTX2富集区与H3K27me3富集区重叠，而H3K4me3富集区在PAX3和PAX6的TSS处观察到，表明存在二价体模式，并且总体转录沉默(图3b)。OTX2与PAX3和PAX6的直接结合通过OTX2CHIP-qPCR在三个3MB细胞系上得到验证(图3c)。作者还处理了包含5个3MB患者样本的数据集，以确定PAX3和PAX6的H3K27me3、H3K27ac和H3K4me3的富集情况。在所有五个样品的PAX3和PAX6处都观察到了广泛的H3K27Me3富集，在TSS处有狭窄的H3K4me3峰，H3K27ac富集可以忽略不计，这与在D283肿瘤球体中观察到的情况一致(图3d)。正如预期的那样，在这些肿瘤中观察到与高OTX2水平相关的OTX2基因调控元件上H3K4me3、H3K27ac的显著富集和H3K27me3的缺乏(图3d)。除了OTX2与PAX3和PAX6的直接结合外，作者还研究了OTX2是否可以与EZH2和SUZ12相互作用。这些蛋白是多梳抑制因子复合体2中的成员，他们通过组蛋白H3在赖氨酸27上的三甲基化来建立转录沉默。免疫共沉淀实验表明OTX2与EZH2和SUZ12相互作用(图3e)。有趣的是，还观察到在肿瘤球体中OTX2沉默后EZH2和SUZ12水平降低(图3f)，这表明OTX2也可以调节这些染色质修饰物的表达。 在OTX2沉默后，在PAX3和PAX6观察到的H3K27me3富集显著减少，这表明OTX2限制了3MB组PAX基因的表达。作者在OTX2沉默后对D283、HDMB03和MB3W1肿瘤球体进行了qPCR。与对照组相比，OTX2沉默的肿瘤微球中Pax3和PAX6的表达显著增加(图3g)。然而只有PAX3在蛋白质水平上维持了这种增加(图3h)。总之，这些结果表明OTX2有助于3MB组PAX3和PAX6表达的表观遗传沉默，并通过多种机制发生，包括OTX2与PAX3和PAX6的直接结合，与染色质修饰复合物的相互作用，以及EZH2和SUZ12水平的调节。 图3 OTX2直接调控3MB组PAX3和PAX6的表达 a.从该网站—https://cellseek./cerebellum/获取了选择基因表达的离散六面体图。将六角网格的基因表达总结为所有组成细胞的平均表达，并与映射到散布六角网格(左上角)的预测细胞类型进行比较。b.在PAX3和PAX6上的调控元件处观察到OTX2富集。c.CHIP-qPCR检测D283、HDMB03和MB3W13MB肿瘤微球中OTX2与PAX3和PAX6的结合。d.按照Boulay等人的最初定义，在5个3MB组患者样本中，H3K4me3、H3K27ac和H3K27me3分别在OTX2、PAX3和PAX6的调节元件上富集。e.免疫共沉淀实验表明，在HDMB03肿瘤球内OTX2和EZH2/SUZ12之间存在蛋白质-蛋白质相互作用。CE细胞提取物。f.在D283、HDMB03和MB3W1肿瘤球体中，OTX2沉默后，FEZH2和SUZ12水平降低。g.3MB肿瘤球经OTX2沉默72h后，PAX3(左)和PAX6(右)的表达明显增加。h.在D283和HDMB03肿瘤球体中，OTX2沉默后，PAX3表达升高，PAX6水平不变。 4. Pax3显著抑制3MB的特性 在3MB中PAX3和PAX6的表达被OTX2直接抑制。因此假设PAX3或PAX6表达增加会降低OTX2高表达的3MB的致瘤性。研究建立了稳定表达PAX3和PAX6的GOFHDMB03 3MB细胞系(图4a，b)。与对照组相比，PAX3和PAX6GOF抑制了肿瘤球的形成(图4c，d)。在转移到继发性肿瘤球体后，只有PAX3 GOF肿瘤球体维持了这种球体数量的显著减少，显示出自我更新能力的下降(图4c，d)。此外，PAX3GOF细胞显示S期细胞频率降低39%，表明对增殖有抑制作用(图4e，f)。在PAX3或PAX6GOF中没有观察到死亡/死亡细胞百分比的变化(图4g，h)。 作者还研究了PAX3和PAX6表达增加对体内肿瘤生长的影响。将1×105个PAX3和PAX6GOF HDMB03细胞注射到NOD-SCID小鼠的小脑内。与对照组相比，只有PAX3 GOF动物的存活率显著增加(图4i，j)，并且伴随着肿瘤大小的减小(图4k)。重复每只动物2.5×104个细胞的原位注射，以进一步评估较低剂量的PAX GOF细胞的致瘤能力。与对照组相比，PAX3 GOF组的存活率再次增加，而PAX6 GOF组的存活率没有显著变化(图4l)。这不归因于PAX6水平的降低，因为过表达在体内持续存在。为了支持肿瘤球体分析，SOX2在PAX3 GOF异种移植瘤中完全取消，而在PAX6 GOF肿瘤中仍然明显的SOX2小簇(图4m)。增殖标记物Ki67的水平在PAX3和PAX6GOF肿瘤中都没有变化(图4m)。βⅢ微管蛋白水平在PAX3GOF肿瘤中有轻微的升高，而在PAX6 GOF肿瘤中有较大的升高。然而βIII微管蛋白抗体不是人类特异性的，为了解决这个问题，还对人类标记STEM121的样本进行了染色。虽然所有肿瘤均呈STEM121强阳性，但不能排除βⅢ微管蛋白染色。综上所述，这些结果表明，PAX3在体外是一种有效的肿瘤特性抑制剂，可以提高3MB的存活率，并在体内消除SOX2水平。 图4 增加PAX3和PAX6的表达降低了第3组MB细胞的致瘤特性 a,b. PAX3(a)和PAX6(b)在HDMB03组3MB肿瘤微球中过表达。c,d.原发和继发肿瘤球体的图像(c)和定量(d)，PAX3和PAX6表达增强。e,f.BrdU掺入分析。仅有7AAD对照(e)的BrdU分析点图，以及对照、PAX3GOF和PAX6GOF肿瘤球体(f)的细胞周期时相的定量。g,h. Annexin V/7AAD分析PAX3和PAX6GOF细胞活力。AnnexinV/7AAD分析的点图(g)和对照、PAX3和PAX6GOF肿瘤球中活/死细胞的定量(h)。数据以平均值±SEM表示。i.PAX3(上)和PAX6(下)的表达增加。j. Kaplan-Meier曲线描述了移植1×105对照、PAX3或PAX6GOF细胞的动物的总存活率。k.来自两个独立对照和PAX3GOF肿瘤的K磁共振成像(左)和来自对照和PAX3GOF异种移植瘤的H&E染色(右)。箭头表示小脑中的肿瘤。l.在2.5×104对照、PAX3或PAX6GOF细胞移植的异种移植中小鼠存活率。m.在对照、PAX6GOF HDMB03MB荷瘤小鼠中Ki67、SOX2和PAX6III微管蛋白水平的分析图像。 5.Pax3对mTORC1信号通路基因具有独特的调控作用 为了区分PAX3和PAX6GOF Group 3MB细胞作用的分子机制，对PAX3和PAX6 GOF HDMB03肿瘤球进行了RNA-SEQ(图5a)。在PAX3GOF和PAX6GOF肿瘤球中分别鉴定了1564和1542个差异表达基因(图5b，c)。大多数差异表达基因在PAX3或PAX6GOF肿瘤微球中表达上调或下调(71.99%在PAX3GOF中，71.59%在PAX6GOF中)。而在PAX3和PAX6GOF肿瘤微球中，186个基因表达上调，182个基因表达下调。基因集富集分析(GSEA)显示，与GABA和谷氨酸受体激活以及PKCA信号相关的基因集在PAX3和PAX6GOF肿瘤球体中下调的基因中得到富集(图5d)。相反，与光感受器信号相关的基因集在PAX3和PAX6 GOF肿瘤球体中上调。GABA、谷氨酸以及光感受器分子标记通常与3MB和4MB相关，从而为使用肿瘤球体作为研究MB进展调控途径的替代模型提供了验证。KEGG途径分析表明，GABA和谷氨酸递质门控离子通道基因在PAX3和PAX6 GOF中都有差异表达(补充图5b)。上皮细胞增殖和干细胞基因，包括CCND1和SOX2，在PAX3和PAX6GOF肿瘤球中同样下调(补充图5c)。在PAX3和PAX6GOF细胞中，一些轴突引导基因的表达也发生了明显变化。例如，EPHB2在两个细胞中均显著上调，而EPHB3在PAX3GOF中唯一上调(补充图5d)。 免疫印迹验证了与神经元分化和自我更新相关的差异表达基因和通路，干细胞标记SOX2在PAX3 GOF中没有被检测到，但在PAX6GOF肿瘤球中仍然存在(图5f, g)。与在体内的数据相似，神经系标记物Doublecourtin(Dcx)和β3微管蛋白(TUJ1)仅在PAX6细胞中显著上调。轴突引导神经发育基因EPHB2在两个PAX GOF肿瘤球体中都增加(图5f，g)，这表明PAX3和PAX6对干细胞和分化基因有不同的影响。由于PAX3 GOF细胞在致瘤特性上表现出更显著的作用，因此进一步评估了mTORC1的活性。mTORC1信号与蛋白质合成的调节有关，这是通过真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)和S6核糖体蛋白的磷酸化介导的。通过检测P-S6和p-4E-BP1(体现mTORC1信号活性)，发现只在PAX3GOF肿瘤球中观察到mTORC1信号活性下降(图5h)。同样，mTORC1上游调节因子RAS同系物RHEB的减少只在PAX3GOF肿瘤球中观察到，而mTORC1复合物的成分pRaptor在PAX3GOF细胞中增加(图5h)。综上所述，这些结果表明PAX3和PAX6诱导了3MB转录特征的改变。然而，只有PAX3降低了SOX2水平，并调节mTORC1信号，从而发现一条潜在的途径，通过这条途径，这个转录因子特异性地促进了3MB细胞的自我更新。 图5 PAX3和PAX6表达扰乱第3组转录特征 a.RNA测序证实，在第3组HDMB03、PAX3和PAX6GOF肿瘤微球中，PAX3和PAX6的表达增加。b.火山图描绘了在PAX3(1564)和PAX6(1542)GOF肿瘤球体中鉴定的差异表达基因的变化。c.维恩图比较了在PAX3和PAX6GOFHDMB03肿瘤球体中发现差异表达的独特和共享的上调或下调基因。d.GSEA显示，GABA受体激活，以及谷氨酸和PKCA信号在PAX3和PAX6GOF肿瘤球体中下调的基因集中富集。与光感受器信号相关的基因在PAX3和PAX6GOF肿瘤球体中通常上调的基因集中富集。e.mTORC1信号在PAX3GOF肿瘤球体中下调的基因组中富集。与MYC靶点相关的基因在PAX6GOF肿瘤球中富集。f.来自RNA测序数据的归一化细胞计数显示，在β3和/或PAX6GOF肿瘤球体中，SOX2减少，TUJ1(PAX3Tubulin)或EPHB2增加。g.验证GOF肿瘤球内SOX2、EPHB2和DCX和βIII微管蛋白水平的变化。h.在PAX3GOF肿瘤球中观察到的总mTORC1活性降低。 6. mTORC1信号与干细胞程序相关 在3MB肿瘤球体中，PAX3的表达与mTORC1活性呈负相关。然而，肿瘤球体是由干细胞、祖细胞和分化程度更高的神经子代组成的异质群体。因此，对来自三个3MB组细胞系的肿瘤球体进行了scRNA-seq，以确定是否在单个细胞水平观察到相似的表达模式。对三个3MB细胞系的分析显示，由细胞周期基因和组蛋白标记的单个簇(补充图6a-c，补充数据4)。OTX2的表达模式与在3MB患者肿瘤中观察到的相似(图2a,b)，在这些肿瘤中，OTX2的表达是可变的，但至少在所有三个肿瘤球群体的大多数细胞中都可以检测到。类似地，mTORC1基因，EIF4EBP1/RPS6，在转录上不同的簇上可变地表达，而PAX基因的表达在整个过程中可以忽略或不表达(补充图6d-f)。使用Hovestadt等人描述的来自组3和组4(组3/4-A、组3/4-B、组3/4-C)的三个元程序来表示循环、未分化和差异化的转录程序，并评估它们在3MB肿瘤球体中的相对表达。未分化的“元程序”以核糖体和翻译/延伸因子基因为特征，并与所有三个肿瘤球体群体在转录上不同的簇之间有一个高的元核心相关。相关数据表明，未分化程序与细胞周期呈负相关，而与蛋白质合成/翻译起始和核糖体生物发生相关的基因呈正相关(补充图6g-I，补充图7a,b)，而且几乎90%的3MB肿瘤细胞与这种未分化的细胞代谢程序有关。 为了进一步了解转录上不同簇的细胞身份以及mTORC1信号与这些簇的关联，整合了来自所有三组肿瘤球体的scRNA-seq数据(图6a-c)。与单个细胞系的结果相似，未分化程序与细胞周期呈负相关，而未分化程序与翻译启动呈正相关(图6d，e)。此外，还观察到未分化程序与mTORC1基因之间存在正相关，细胞周期与mTORC1基因之间存在负相关(图6f，g)。对单个集群身份进行进一步分析，观察到nestin(NES)在簇3中的高表达。此外，簇1、2和4表达更分化的单极刷状细胞标记Eomesodermin(Eome；图6h，i)。簇3和4似乎具有跨簇的最低循环分数，而簇4代表更具分化的表型(图6j)。重要的是，翻译启动以及特异性的mTORC1基因在所有簇中广泛表达，但在低周期的NES+细胞室中表达最高(图6j)。 scRNA-seq数据表明，mTORC1基因与未分化的干/祖细胞3MB细胞群相关，即mTORC1信号是调节3MB组细胞命运的自我更新程序的组成部分。 图6 对3MB肿瘤球体的综合scRNA-seq分析揭示了未分化干/祖细胞状态与mTORC1基因表达特征之间的关系 a-c.来自D283、HDMB03和MB3W1(a)的整合肿瘤球体数据的UMAP，来自整合数据(b)的细胞周期相，以及来自整合数据(c)的转录上不同的细胞群体。d-g.相关图显示未分化程序和细胞周期(d)之间的关系，以及未分化程序和翻译起始(e)、未分化程序和我们的mTORC1基因签名(F)以及来自整合的肿瘤球体数据的细胞周期和mTORC1基因签名(g)之间的关系。mTORC1基因签名与广泛的翻译起始程序重叠，但基于补充数据8中提供的基因精选列表，其中大部分与mTORC1信号的4E-BP1和S6核糖体蛋白臂相关，也是直接的OTX2靶标。h,g.神经干细胞标记物Nestin(NES)和分化的单极刷状细胞标记物Eomesodermin在整合的肿瘤球体数据簇中的表达。j.表达细胞周期、未分化、分化和翻译启动程序，以及mTORC1基因在整合的肿瘤球体数据中跨簇的表达特征。 7. 在第3组MB细胞中，OTX2沉默降低了mTORC1的活性 PAX3表达增加与OTX2沉默有相似的功能，包括自我更新和增殖的降低，故推测OTX2沉默也会降低mTORC1的活性。首先检查了与D283肿瘤球体中OTX2沉默时H3K4me3和H3K27me3发生显著变化的基因相关的通路。参与调控真核细胞起始因子2(EIF2)信号、mTORC1(eIF4和p70S6K(p-S6))或mTOR信号的基因仅在H3K4me3中显示出显著变化(图7a-c，补充数据5-7)。进一步分析表明，许多mTORC1相关基因也显示出OTX2峰和基序，这表明它们可以直接由OTX2调节(补充数据8)。这些特异的OTX2-结合峰不含PAX3基序(补充数据8)，提示PAX3可能在不同的调控元件上调控mTORC1基因。而且在OTX2沉默之后，mTORC1中心的基因在表观基因组水平上显示出显著的变化。 为了验证这些发现，沉默了3MB肿瘤球体中OTX2的表达，并检测了mTORC1的活性。在HDMB03和D283肿瘤球体中沉默OTX2导致SOX2减少，DCx和βⅢ微管蛋白增加(图7d,e)，mTORC1活性的总体下降以及p-S6，p-4e-BP1和RHEB水平的降低(图7d，e)。只有在D283肿瘤球体中OTX2沉默后，才能观察到pRaptor的小幅增加。总之，这些结果表明，OTX2沉默现象复制了在PAX3 GOF肿瘤球体中观察到的mTORC1活性的降低，表明这一途径与3MB组中的干细胞/祖细胞表型密切相关。 图7 3MB细胞PAX3和PAX6GOF中OTX2的丢失 a-c. EIF2和mTORC1信号(高亮显示)与在3MB肿瘤球体中OTX2沉默后H3K4me3修饰有显著变化的基因相关。d,e.在HDMB03(d)和D283(e)肿瘤球中沉默OTX2可降低SOX2、p-S6、p-4e-BP1和Rheb水平。D283肿瘤球神经元分化标记物DCx、EPHB2和βIIItubulin小幅增加。f.富集的生物学过程和途径使用GSEA(以FDR校正的Q值<0.25为条件)确定，并使用Enrichmentmap作图。图中的每个节点表示一条途径、一个过程或一个转录因子富集。节点的大小与过程中的基因数量成正比。当这些节点共享丰富的基因时，它们是相连的。带星号的节点表示Q<0.05丰富的过程。g.3例独立的FFPE第3组(上)和第4组(下)MB标本中p-S6和p-4EBP1免疫组化染色的代表性图像。比例=200μm。 8. MTORC1活性调节第3组MB肿瘤特性 PAX3 GOF肿瘤微球中mTORC1信号的独特下调可能是导致PAX3GOF动物自我更新能力降低和存活率提高的潜在机制。因此在3MB组中评估双重mTORC1/2抑制剂的效果，因为mTORC1特异性抑制剂在临床上基本上宣布失败，部分原因是在阻断mTORC1时释放了对mTORC2/AKT信号的抑制。首先利用763MB患者样本的基因表达数据进行了途径富集分析，以确定3MB组肿瘤中蛋白质合成和/或mTORC1途径基因是否上调。事实上，与所有其他MB亚型相比，第3组β和第3组γ中的rRNA加工、核糖体成熟和激活、翻译起始、翻译和翻译后蛋白靶向以及myc相关基因都上调了(图7F)。被OTX2激活的TF锥杆同源盒(CRx)的基因靶点也在第3组β和第3组γMB中富集。 作者还检测了3MBFFPE肿瘤切片中mTORC1的活性。3MB患者样本显示一定范围的p-S6和p-4e-BP1染色阳性(图7g)。同样具有高OTX2表达的第4组MB肿瘤显示p-S6(图7g)，尽管在较小的子集中程度较小，以及p-4e-BP1染色阳性的范围(图7g)，这表明具有活跃mTORC1信号的细胞在两个MB亚组中都是可治疗的靶向细胞群。 作者评估了双重mTORC1/2抑制剂：AZD8055和药物PQR620在3MB肿瘤球中的疗效，AZD8055处理3h后，p-S6显著减少，而对p-AKT(MTORC2)仅有少量的抑制作用(图8a)。PQR620处理也导致p-S6的剂量依赖性降低，但24小时后对p-AKT的影响可忽略不计(图8b)。因此，在3MB模型中，这两种药物对mTORC1活性的影响更为明显。而且观察到AZD8055和PQR620处理后，EZH2水平下降，这表明mTOR信号也可以调节MB中的PRC2复合蛋白水平。 与AZD8055不同，PQR620已被证明可以穿越血脑屏障。因此，在体内检测了PQR620治疗的效果。PQR620治疗的荷瘤NOD-SCID小鼠显示肿瘤生长显著减少(图8c)。与体内的PAX3GOF肿瘤相似，PQR620处理的肿瘤也表现出SOX2降低以及βⅢ微管蛋白水平升高(图8c)。正如在PAXGOF肿瘤中观察到的，主要的肿瘤肿块是STEM121阳性，特别是在肿瘤/小鼠脑边界(图8c，补充图8a)。此外，Ki67水平在治疗后最低限度降低(图8c)，这些表型变化还伴随着存活率的显著增加而发生改变(图8d)。总而言之，这些结果表明PQR620在高度侵袭性的3MB异种移植模型中显著降低了致瘤性。 为了进一步阐明这些抑制剂在细胞命运决定中的潜在作用，评估了AZD8055和PQR620对肿瘤球体形成和自我更新的影响。AZD8055分别显著抑制或完全消除了3MB肿瘤球体的形成，同时增加了细胞死亡(图8e，f，补充图8b，c)。PQR620也获得了类似的结果(图8g，h，补充图8d-e)。研究还发现AZD8055抑制HDMB03的自我更新(图8i，j，补充图8g，h)，这也与SOX2水平的降低有关(图8k，上图)。与PAX3GOF肿瘤球类似，在致死浓度下没有观察到βⅢ微管蛋白(图8k上图)和PQR620(图8k下图)的增加，而SOX2强烈减少，说明βⅢ微管蛋白在较低浓度下没有变化。总而言之，这些结果表明mTOR信号调节3MB组的干细胞属性。 图8 mTORC1信号调节3MB组肿瘤球体的形成和自我更新 a,b.3MB组AZD8055(a)或PQR620(b)处理3h后，mTOR信号转导和EZH2水平均明显高于AZD8055(a)和PQR620(b)组。c.H&E以及STEM121，Ki67，SOX2，和βⅢ微管蛋白水平在对照组和PQR620HDMB03型荷瘤NODSCID14天后的免疫组织化学图像。d.移植HDMB03肿瘤球1×105细胞。e.AZD8055处理HDMB03组3MB细胞后肿瘤球的图像。f.AZD8055处理的HDMB033MB肿瘤球总球数(上)和存活率(下)。g.HDMB03 PQR620处理后肿瘤球数的图像。h.用PQR620HDMB03处理后，对总球数(上)和活性(下)进行定量。i,j.AZD8055处理(25-100nM)后原发(i)和继发(j)HDMB03肿瘤球数和存活率的定量分析。k.Westernblotting显示，AZD8055(上)或PQR620(下)处理HDMB03肿瘤球24-72h后，SOX2、βIIItubulin和切割的caspase3水平明显升高。l.模型演示了OTX2-PAX3轴通过控制mTORC1信号来调节细胞命运的决定。 讨论 研究OTX2在3MB进展中的作用主要集中在细胞周期基因的表观遗传和转录激活上，mTORC1信号的下游效应可能由OTX2直接调节，也可能通过调节PAX基因的表达间接调节（图8l）。这一回路可能控制3MB干/祖细胞的关键细胞命运决定，从而扩大OTX2在MB发病机制中的调节范围。 有研究报道了OTX2在调节3MB的H3K27me3修饰中的作用，当OTX2被下调时，PAX3、PAX6表达明显增加。这两个基因都是OTX2的直接转录靶点，并且在OTX2沉默后，H3K27me3的表达显著减少。此外，OTX2在调节TF表达方面发挥了更大的作用。OTX2直接与PAX3和PAX6等基因结合，与染色质修饰复合物相互作用，调节EZH2和SUZ12的表达，这些都是OTX2抑制神经分化的机制。 确定PAX3和PAX6的表达与患者样本中存活率的增加相关，并且在3MB组中直接被OTX2抑制。特别是PAX3的过表达在体外显著抑制了3MB的致瘤特性，同时在小脑内移植模型中提高了存活率，这与PAX3在其他脑肿瘤中的作用形成对比，因为在其他脑肿瘤中，PAX3已被证明是致癌基因。PAX基因家族协调众多的发育程序，包括自我更新和神经元分化。虽然PAX6已被证明能够特异性地控制神经干细胞自我更新和分化之间的平衡，但人们对PAX3如何调控这些过程知之甚少。PAX3和PAX6在体外都不同地影响3MB细胞的命运；然而，OTX2-PAX3特异性地调节mTORC1信号。此外，PAX3能够提高体内存活率。因此在3 MB中，PAX3和PAX6在功能上并不重叠。 神经发育程序是如何在3MB进展期间发生改变的？这些高度侵袭性的肿瘤与几个分子信号有关，包括GABA，谷氨酸信号，以及光感受器分化程序。RNA-SEQ结果表明，在PAX3和PAX6GOF HDMB03肿瘤球体中，这些3MB特征都富集在上调或下调的基因组中。此外，scRNA-seq数据显示，在3MB患者样本中广泛表达的未分化祖细胞程序富集，其特征是与蛋白质合成相关的基因。多组学数据和随后对AZD8055和PQR620的原理研究提供了通过抑制mTOR信号来靶向治疗耐药的3MB干/祖细胞的理论基础。有研究表明双重PI3K/mTOR抑制剂在治疗MYC过表达的基因工程3MB小鼠模型中是有效的。然而，mTORC1信号作为人类3MB细胞命运调节器的具体作用之前还没有报道。 该研究对OTX2在3MB进展中的作用进行了更加全面的探究，进一步探讨了OTX2在高度异质的MB神经谱系细胞层次中的重要性，对于揭示MB细胞命运和转移的不同甚至更复杂的作用有重要指示性作用。例如，OTX2和PAX3在WNTMB肿瘤中高表达。由于与3MB相比，WNT亚组的总体预后非常好，OTX2的功能贡献明显具有亚组依赖性。单细胞测序小鼠小脑数据的分析表明，OTX2+和Pax3+细胞可能有不同的发育起源。因此需要更多的研究来更好地理解所有OTX2+谱系的生物学，进一步研究它们的转录本，进而识别出可以进一步用于治疗这些高度侵袭性肿瘤的其他关键分子。 https://www.ncbi.nlm./pmc/articles/PMC7371715/
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