【原】科研 | Nat. Commun.：非酒精性脂肪肝相关性肝癌患者的肠道菌群或抑制外周免疫

微科享 2021-04-19

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编译：微科盟北越城主，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

前期研究发现肠道菌群可调节肝细胞癌（HCC）的免疫反应。在本研究中，我们采用宏基因组学和代谢组学技术来表征非酒精性脂肪肝（NAFLD）相关性肝硬化患者（无论是否患有HCC）的肠道菌群，并在离体模型中评估其对外周免疫应答的影响。我们发现随着肝癌的病理发展肠道菌群发生组成和功能改变，NAFLD-肝硬化患者的微生物群紊乱是其主要特征，而对NAFLD-HCC中微生物群的基因功能分析发现短链脂肪酸的合成变化，并通过代谢组学研究得到证实。离体研究表明，NAFLD-HCC微生物群（而非对照组）的细菌提取物会引起T细胞免疫抑制，其特征在于调节性T细胞的扩增和CD8⁺T细胞的衰减。我们的研究表明，NAFLD-HCC中的肠道菌群具有独特的微生物组/代谢组学特征，并且可以调节外周免疫应答。

论文ID

原名：Gut microbiota impact on the peripheral immune response in non-alcoholic fatty liver disease related hepatocellular carcinoma

译名：非酒精性脂肪肝相关性肝癌患者的肠道菌群或抑制外周免疫

期刊：Nature Communications

IF：12.121

发表时间：2021.01

通讯作者：Amany Zekry

通讯作者单位：新南威尔士大学

实验设计

实验结果

1. 队列研究的基础生理指标特征

这项研究共招募了90名受试者；NAFLD-HCC患者32例，NAFLD肝硬化患者28例，非NAFLD对照患者30例。所有组的年龄，性别和BMI均匹配（表1）。

所有受试者NAFLD-HCC和NAFLD-肝硬化的瞬时弹性成像评分与肝硬化结果一致(表1)。我们根据肝功能分级和模型对NAFLD-HCC和NAFLD-肝硬化患者的肝病严重程度进行匹配终末期肝病钠(MELD-Na)评分(表1)。NAFLD-HCC组和NAFLD-肝硬化组的肝脏生化指标无差异，在临床、影像学或内窥镜检查中均无门静脉高压的证据。

在NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化组中，II型糖尿病，原发性高血压，血脂异常或二甲双胍的使用均无差异（表1）。然而，与非NAFLD对照相比，患有肝病（NAFLD-HCC或NAFLD-肝硬化）的受试者的代谢疾病（II型糖尿病，原发性高血压和血脂异常），二甲双胍的使用和肝脏患病率更高（表1）。

所有患有NAFLD-HCC的受试者均接受了手术切除（具有治愈意图）以治疗HCC，并在组织学上证实了肝硬化和HCC。表2显示了其他相关的肿瘤特征，包括肿瘤数量，大小，巴塞罗那临床肝癌（BCLC）分期，肿瘤等级，术前HVPG和甲胎蛋白水平。

表1 研究队列的基线特征

数值用平均值(±SD)或%表示。P值的计算采用单因素方差分析，对连续变量采用T检验，对二元变量采用卡方检验和Fisher精确检验。P<0.05为有统计学意义。在NAFLD -肝硬化组和NAFLD-HCC组中，所有变量均无显著差异。BMI体重指数，终末期肝病的MELD-Na模型-钠，谷丙转氨酶，天门冬氨酸转氨酶，国际标准化比值，ns无统计学意义。

表2 NAFLD-HCC组的肿瘤特征

BCLC阶段巴塞罗那临床肝癌阶段，HVPG肝静脉压力梯度。

2.外周血中的基线免疫细胞定量

与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC受试者在基础生理指标上具有更高比例的调节T细胞（Tregs;CD3⁺ CD4⁺CD25⁺ Foxp3⁺）（图1）。相反，NAFLD-HCC受试者的CD8⁺ T细胞（CD3⁺ CD8⁺ ）百分比低于NAFLD肝硬化和非NAFLD对照（P= 0.017）（图1）。NAFLD肝硬化和非NAFLD对照之间的Tregs或CD8⁺ T细胞百分比没有差异（图1）。

图1 与NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC的受试者在基线时有外周免疫抑制

调节性T细胞(Tregs;CD3⁺ CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ )和CD8⁺ T细胞(CD3⁺ CD8⁺ )在非NAFLD对照、NAFLD肝硬化和NAFLD-HCC受试者的外周血单个核细胞(pbmc)的定量结果。非nafld对照30例，nafld肝硬化28例，nafldhcc 32例，作为生物独立样本。数据以CD3⁺ 淋巴细胞百分比表示。3组比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)计算P值。

3.宏基因组测序证实了肝病中的营养不良，并在NAFLD-HCC中鉴定出一个产生SCFA的肠道微生物菌属

与非NAFLD对照相比，粪便样品的宏基因组测序证实了NAFLD-HCC和NAFLD-肝硬化的营养不良（图2a，b）。与非NAFLD对照相比NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化患者的降低了α-多样性指数和观察到的物种数量（图2a）。与非NAFLD对照组相比，NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化患者在控制年龄和性别时通过原则约束分析（CAP）确定的β-多样性显着不同（图2b）。

在门的水平上，与非NAFLD对照相比NAFLD-HCC的显著特征是变形菌门丰度显著增加，而与NAFLD肝硬化相比则没有变化（图2c）。同时在门水平上，各组之间没有其他差异，但是，在科的水平上，与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照相比，在NAFLD-HCC中观察到肠杆菌科丰度显著增加。与非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC的显著特征还在于减少了Oscillospirace和Erysipelotrichaceae，但与NAFLD肝硬化相比却没有变化（图2d）。另外，在NAFLD-肝硬化队列中，我们在科的水平上观察到了微生物组组成的变化。与NAFLD-HCC（P= 0.013）和非NAFLD对照相比，NAFLD肝硬化的特征是真杆菌科的丰度显著增加（图2d）。此外，与非NAFLD对照相比，我们在NAFLD肝硬化患者中观察到了结肠杆菌科丰度的增加和几种拟杆菌丰度的减少：包括毛霉菌科，恶臭杆菌科和原核科（图2d）。

在物种水平上，我们对微生物组的分析发现与非NAFLD对照相比，发现在NAFLD-HCC和NAFLD-肝硬化中均显着富集的常见细菌物种（图2e），包括木杆菌，鲁米诺球菌和博氏梭状芽胞杆菌（图2d）。重要的是，LEfSe分析发现了B.caecimuris和V.parvula能将NAFLD-HCC与NAFLD肝硬化区分开来。因此， NAFLD-HCC微生物组富含五个细菌物种（图2e），而先前有报道它们是具有免疫调节能力的SCFA生产者。

图2 患有NAFLD-HCC，NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照的受试者的粪便微生物分析

a.基于非NAFLD对照，NAFLD-肝硬化和NAFLD-HCC粪便样本中观察到的物种数量的Alpha多样性。b.使用原则约束分析（CAP）（按年龄和性别控制）的Beta-多样性。c.在非NAFLD对照，NAFLD肝硬化和NAFLD-HCC粪便样本中门水平的微生物组组成变化。d.在非NAFLD对照，NAFLD肝硬化和NAFLD-HCC粪便样本中科水平的的微生物组组成变化。e.与非NAFLD对照粪便样本相比，患有NAFLD-HCC，NAFLD-肝硬化粪便样本中丰度最高的5种菌株。

4. 从膳食纤维中合成短链脂肪酸的细菌基因是NAFLD-HCC患者微生物组的最重要特征

为了确认富含NAFLD-HCC微生物的物种具有产生SCFA的能力，我们测量了来自NAFLD-HCC，NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照的样本粪便中负责SCFA合成的细菌基因的丰度（图3a）。

在先前研究中显示对SCFA合成很重要的21个候选基因中，五个基因的丰度在各组之间显着不同，更重要的是，与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC中负责由丙酮酸生产草酰乙酸的丙酮酸羧化酶（pycA）过度表达（P= 0.004）（图3b）。此外，与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC中与乙酸酯合成（磷酸乙酰转移酶；pta）和丁酸酯/乙酰磷酸合成（磷酸丁酰转移酶；ptb）相关的基因均过表达（图3b）。但是，并非所有对乙酸盐和丁酸盐合成重要的基因都在NAFLD-HCC微生物组中过表达，例如，对于乙酸激酶（ackA）和丁酸激酶（butK），各组之间的基因表达没有差异。

此外，与非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC微生物组中丙酸合成途径中的两个基因，即富马酸还原酶（frd）和琥珀酸-CoA合成酶（sucC）过表达。但是，在NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化之间未见这些基因丰度的差异，在NAFLD肝硬化和非NAFLD对照之间未见差异（图3b）。

图3 从膳食纤维中合成短链脂肪酸的细菌基因是NAFLD-HCC患者微生物组的最重要特征

a.微生物介导的短链脂肪酸合成途径。b.与NAFLD-肝硬化和非NAFLD-对照相比，NAFLD-HCC粪便SCFA合成基因的相对丰度变化。pycA丙酮酸羧化酶，pta

磷酸乙酰基转移酶，磷酸ptb磷酸丁酰基转移酶，富马酸frd还原酶，sucC琥珀酸-CoA合成酶，KO KEGG Orthology。

5. 代谢组学研究表明，NAFLD-HCC受试者的粪便和血清中SCFA及其中间体的浓度升高

我们对来自NAFLD-HCC、NAFLD肝硬化和非NAFLD对照的粪便和血清样本对进行了代谢组学研究，以测量SCFA及其中间体。

在粪便中，我们用LC–MS/ MS测定了对细菌代谢过程重要的65种代谢物，发现NAFLD-HCC患者中有三个具有特征的代谢物变化，包括草酰乙酸，乙酰磷酸和异柠檬酸。草酰乙酸和乙酰磷酸是已知的SCFA中间体（图3a），与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC受试者的粪便中粪便的乙酸草酸酯和乙酰磷酸盐显着升高（图4a），而NAFLD-HCC粪便中的异柠檬酸水平低于NAFLD肝硬化和非NAFLD对照（P<0.0001）。

接下来，我们使用¹H-NMR对粪便和血清样品中的六个关键SCFA进行绝对定量。与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC受试者的粪便富含乙酸，丁酸和甲酸（图4b），因此，这些粪便SCFA的增加是NAFLD-HCC的重要特征。但是两组之间的粪便中丙二酸，丙酸或戊酸水平没有显着差异。与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照相比，在血清中，我们确定了NAFLD-HCC中丁酸和丙酸水平升高（图4c）。因此，这些血清SCFA的增加是NAFLD-HCC的重要特征。与非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化患者的血清丙二酸均升高，但是，NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化组之间无差异（图4c）。两组之间的血清中乙酸，甲酸和戊酸水平无显着差异。

图4 与NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照组相比，来自NAFLD-HCC患者的粪便和血清的一些短链脂肪酸(SCFA)和短链脂肪酸中间体水平升高

a.在NAFLD-肝硬化、非NAFLD对照和NAFLD-HCC受试者粪便样品中短链脂肪酸中间体的相对定量分析。b.NAFLD-肝硬化、非NAFLD对照和NAFLD-HCC受试者粪便样本中短链脂肪酸的绝对浓度。c.NAFLD-肝硬化、非NAFLD对照和NAFLD-HCC受试者血清样本中短链脂肪酸的绝对浓度。

6. 体外研究表明，NAFLD-HCC微生物群引起免疫抑制反应

在动物和体外研究中，某些细菌和SCFA已显示出直接促进免疫抑制反应的作用。因此，在表征了NAFLD-HCC受试者中的微生物群组成和相关的粪便代谢组学之后，我们的目标是在离体细胞培养模型中研究微生物群对外周免疫应答的影响。在各种刺激条件下，我们用来自每个NAFLD-HCC（n= 10），NAFLD肝硬化（n= 10）和非NAFLD的单个细菌提取物（BE）刺激了来自非NAFLD对照（n= 10）的单个外周血单核细胞（PBMC）样品。这些BE是根据NAFLD-HCC中的α多样性（321.8±11.53；观察到的物种数的平均值±标准偏差）和NAFLD肝硬化（325.2±2.74）以及非NAFLD对照组（343.8±2.10）中大多数粪便样本里多样性最少的粪便样本制备的。我们的模型产生了总共800个样本和7270流式细胞仪读数。

7.NAFLD-HCC菌群诱导IL-10⁺ Treg效应物的扩增，同时减弱细胞毒性CD8⁺ T细胞的扩增

来自NAFLD-HCC受试者的BE诱导的Tregs扩增超出了NAFLD肝硬化和非NAFLD对照中的Tregs扩增水平（图5a）。我们确定了这种扩增的Treg群体的表型，并证实与非NAFLD对照BE相比，来自NAFLD-HCC受试者的BE诱导了效应IL-10⁺ Treg（CD3⁺ CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ IL-10⁺ ）的扩增，而与NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照BE相比，来自NAFLD-HCC受试者的BE减弱了总CD8+ T细胞（CD3⁺ CD8⁺ ）的扩增（图5b）。我们证实该观察结果不是细胞凋亡的结果。此外，我们观察到来自NAFLD-HCC受试者的BE减弱了细胞毒性CD8⁺ T细胞（CD3⁺ CD8⁺ CCR7^- CD45RO^-）的扩增，并促进了中央记忆CD8 + T细胞（CD3⁺ CD8⁺ CCR7⁺ CD45RO⁺）的出现。

同样，与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照BE相比，来自NAFLD-HCC受试者的BE减弱了总CD4⁺ T细胞（CD3⁺ CD4⁺）的扩增，而在T辅助细胞（Th1；CD3⁺ CD4⁺ Tbet⁺）人群中未见明显变化。

图5 来自NAFLD-HCC受试者的细菌提取物(BE)在非NAFLD受试者的PBMCs中诱导了免疫抑制表型

a.在非NAFLD对照、NAFLD-肝硬化和NAFLD-HCC组的Tregs(CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)的Fold变化。b.CD8⁺ T cells (CD3⁺CD8⁺)的Fold变化。c.单核细胞抗原递呈细胞(monocytes; CD3−CD14⁺)的Fold变化。d.B cells (CD19⁺CD20⁺)的Fold变化。

8. NAFLD-HCC微生物群改变了抗原呈递环境

为了进一步表征外周免疫反应的变化，我们在离体模型中测量了抗原呈递细胞群，包括单核细胞（CD3-CD14⁺），髓样树突状细胞（CD3-HLADR⁺CD11c ⁺）和B细胞（CD19⁺ CD20⁺）。与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照BE相比，来自NAFLD-HCC受试者的BE减弱了单核细胞的扩增（P= 0.002）（图5c）。同样，与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照BE相比，来自NAFLDHCC受试者的BE减弱了B细胞的扩增（P= 0.006）（图5d）。

9.NAFLD-HCC微生物群引发了支持免疫抑制的细胞因子环境

研究表明IL-2和IL-12（p70）在CD8⁺ T细胞的扩增和激活中很重要。我们观察到，与NAFLD-HCC相比，NAFLD-HCC受试者的BE抑制了这些促炎性细胞因子的产生。此外，与非NAFLD对照BE相比，NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化BE均会抑制IL-4的产生（图6）。与NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照BE相比，NAFLD-HCCBE诱导了IL-6和抗炎细胞因子IL-10的相应增加（图6）。

图6 NAFLD-HCC患者的细菌提取物(BE)改变了促/抗炎细胞因子环境

加入非NAFLD对照，NAFLD-肝硬化和NAFLD-HCC细菌提取物（BE）后，PBMC培养基中的细胞因子定量。样本量为n = 10的非NAFLD对照，n = 10的NAFLD-肝硬化，n = 10的NAFLD-HCC作为生物学独立的样本。

10. 相关模型证实了NAFLD-HCC微生物群与丁酸和免疫抑制反应之间的联系

为了评估NAFLD-HCC富集物种的丰度，粪便代谢产物的浓度与我们离体模型中引起的T细胞反应之间的关系我们进行了相关分析。此外，肠道微生物与免疫反应之间显着的相关性与我们观察到的实验结果一致。具体来说B. caecimuris, B. xylanisolvens,和C.bolteae与IL-10⁺ Tregs效应器正相关，而更重要的是，B.caecimuris, B. xylanisolvens,也与CD8⁺ T细胞呈负相关，突显了这些类群在调节适应性免疫中的重要性。此外，V.parvula与Tregs正相关，但与IL-10⁺ Tregs效应物无正相关，与CD8⁺ T细胞负相关，而R.gnavus与细胞毒性CD8⁺ T细胞呈负相关，与Tregs或效应IL-10⁺ Tregs却不相关（图7a）。

关于SCFA及其中间体，我们在丁酸和Tregs和效应物IL-10⁺ Tregs（R= 0.69，P= 0.031）之间发现正相关，这一发现支持先前的报道。体外研究表明，丁酸酯可诱导PBMC中的Treg群体；此外，在丁酸盐和细胞毒性CD8⁺ T细胞之间发现负相关，再次凸显了这种SCFA在调节外周免疫应答中的重要性。我们在乙酰磷酸盐，草酰乙酸盐，乙酸盐或甲酸盐与Tregs或CD8⁺ T细胞之间未发现明显的正相关或负相关（图7b）。

图7 NAFLD-HCC微生物群与丁酸和免疫抑制反应之间的联系

a.NAFLD-HCC微生物群与免疫抑制反应之间的相关性分析。b.丁酸与免疫抑制反应之间的相关性分析。

讨论

肠道菌群及其代谢产物已被认为是肝癌发展的重要辅助因素，HCC的发展正是通过肠-肝轴与免疫相互作用发生的。在这项研究中，我们采用了宏基因组学和代谢组学分析方法，以鉴定将NAFLD-HCC与NAFLD肝硬化区分开的微生物组的结构和功能变化。此外，我们利用体外NAFLD-HCC细胞模型来证明该微生物群及其代谢产物对外周免疫的特异性作用，这个发现具有重要的临床意义。

多条证据表明肠营养不良被认为是肝硬化的重要特征之一。尽管使用了不同的对照组和不同的地理区域，但来自我们队列和其他研究组的人类宏基因组学数据仍支持NAFLD肝硬化的新出现的核心微生物组特征，即高丰度的R.gnavus, C. bolteae, Streptococcus parasanguinis和 Klebsiella pneumoniae，低丰度的有益菌Faecalibacteriumprausnitzii, Alistipes putredinis 和Eubacterium eligens。我们进一步确定了V. parvula和B.caecimuris是将NAFLD-HCC与NAFLD-肝硬化区分开来的特征菌群。同样，在我们和其他研究中，也观察到检测到的NAFLD肝硬化代谢物存在一些相似特征，即色氨酸向吲哚甲酸甲酯的微生物代谢增加。因此，新出现的数据支持了粪便微生物和代谢组学作为诊断标记物的潜力。

至于肝癌特有的微生物特征，相关的数据正在涌现。与我们的发现一致，对NAFLD-HCC患者进行的16SrRNA分析检测到了拟杆菌属和球菌科成员的富集，这与几种全身性炎症和免疫标志物相关。研究人员使用16SrRNA分析对慢性乙型肝炎相关肝癌患者的粪便标本进行分析，能够检测到HCC特异性微生物标志物，这些标志物已在其他中国人群中成功进行了交叉验证。与我们的发现和其他发现相反，Ren等在早期肝癌患者中发现产生丁酸盐的细菌家族减少了，如Ruminococcus，Oscillibacter，Faecalibacterium，ClostridiumIV和Coprococcus，这些不同的发现可能是由于研究人群的显着差异。在Ren等人的研究中，与我们的高BMI队列相比，慢性乙型肝炎的感染是该研究人群潜在的肝病的病因，此外，其BMI较低。显然，以上结果表明仍然需要在大型队列研究中进行充分验证，以确定HCC微生物组的肝脏疾病特异性改变。

我们进一步观察到NAFLD-HCC中的微生物组富含膳食纤维合成SCFA所需的基因，包括丙酮酸羧化酶，磷酸乙酰转移酶和磷酸丁酰转移酶。NAFLD-HCC患者粪便和血清中的SCFA（尤其是丁酸）及其中间体的浓度超过了NAFLD-肝硬化患者的水平，这表明NAFLDHCC中的微生物具有协同作用，从而增加了SCFA的产生。确实，已经报道了肥胖的NAFLD患者的粪便SCFA水平升高，但是，我们的研究人群与BMI相匹配，因此，肥胖本身不能解释NAFLD-HCC中SCFA浓度升高的原因，并且更可能归因于该NAFLD-HCC患者的微生物群的分布。为了支持我们的发现，最近的动物研究表明，在肠道营养不良的情况下，喂食高纤维饮食的小鼠表现出体内SCFA浓度升高（特别是丁酸盐），从而促进肝细胞增殖，肝纤维化并因此促进HCC。此外，已观察到用万古霉素治疗黑色素瘤动物模型可通过消除瘤胃球菌科和链霉菌科成员降低SCFA浓度，从而改善对放疗的反应并减轻肿瘤负担。这些研究推测，大量SCFA的产生，特别是在生物失调情况下丁酸的产生，可能反而会创造出一种促进肿瘤的微环境。但是，与SCFA的炎症和促进肿瘤的潜力相反，其他研究人员发现，喂食高纤维饮食的小鼠的SCFA循环水平增加，并受到保护免受炎症和癌症的侵害。这种与SCFA相关的功能悖论支持以下观点：SCFA在细胞水平上的功能取决于细胞类型和暴露量。沿着这一思路，新兴文献支持以下观念：SCFA剂量增加（超过宿主可耐受的阈值）更有可能促进组织炎症和促肿瘤，其作用超过其任何有益作用。

在提出的离体模型中，NAFLD-HCC中的肠道菌群促进了总的IL-10⁺ Treg和效应子Treg的扩增，而CD8+ T细胞的扩增却减少了。先前已证明某些已鉴定的NAFLD-HCC中微生物物种的菌群在调节Tregs的表达中起关键作用，而在结肠炎的动物模型中，几种梭菌菌株和R.gnavus导致免疫应答偏向Treg应答。此外，人类微生物菌群在无菌小鼠中的定殖已被鉴定出能够诱导Treg以及IL-10的梭状芽胞杆菌菌株的混合物。研究表明Treg促进免疫耐受，Treg介导的细胞毒性CD8+ T细胞功能的减弱在该过程中至关重要。IL-2是CD8⁺ T细胞活化和扩增所必需的，IL-2的Treg消耗被认为是Treg减弱外周血CD8+ T细胞的机制。这种互逆的T细胞表达谱是由患有NAFLD-HCC但非肝硬化的患者的菌群离体引起的，这表明NAFLD-HCC菌群具有特异性的免疫调节作用。

除了上述数据外，我们的相关模型还证实了富含NAFLD-HCC粪便的代谢物丁酸与引发的T细胞反应之间存在联系。先前的离体研究表明，通过增强Foxp3表达的机制，SCFA特别是丁酸与PBMC的孵育会以浓度依赖的方式引起Treg的扩增。我们的体外和相关模型相结合，证明了NAFLD-HCC中的病菌病（微生物组和相关代谢产物）对T细胞反应的集体作用。

我们还观察到丁酸盐与细胞毒性CD8⁺ T细胞负相关，与动物数据一致，表明丁酸盐可直接减弱抗原特异性CD8+ T细胞反应。与此相反，其他研究者显示丁酸酯可增强CD8⁺ T细胞效应子的功能。同样，这表明丁酸酯的功能取决于其剂量和特定的细胞环境。

微生物群及其代谢产物调节免疫反应的能力与HCC主题有关。研究显示，肝癌患者外周血中循环Treg的升高可独立预测不良预后。同样，由于抗肿瘤CD8+ T细胞反应的恢复，在接受全身治疗的HCC患者中循环Treg水平的降低与更好的治疗和疾病结局相关。最近的研究证实了肠道菌群在促进或抑制抗癌CD8⁺ T细胞反应中的重要性。总的来说，基于我们的发现和其他发现，可以推测肠道衍生的干预策略可能对NAFLD-HCC患者恢复CD8⁺ T细胞抗肿瘤反应具有治疗作用。

现在出现了一个问题，即肠道微生物组和/或来自NAFLD-HCC的相关代谢产物如何影响外周免疫反应。研究人员认为，由于肠屏障功能障碍，细菌性产物和代谢产物易位于肝硬化。为此，在有或没有HCC的NAFLD肝硬化患者的外周血中，细菌脂多糖（LPS）和肠屏障功能障碍标志物（zonulin-1）的水平已显示出升高。此外，研究表明，肠道菌群可以指导外周免疫对免疫耐受的反应。在这方面，我们已经在动物模型中证明了响应共生微生物群的Tregs的外周抗原特异性种群的产生，同样，已证明外围免疫细胞对微生物代谢产物（尤其是SCFA）的感应会影响促炎和抗炎免疫细胞之间的平衡，从提出的离体模型中获得的发现提供了证据，即NAFLD-HCC中的微生物群及其代谢产物可以将外周免疫反应引导至免疫抑制表型，该表型与较差的结果相关。

但同时我们的研究也存在一些局限性。首先，从微生物组特征来看，无NAFLD或无肝硬化的代谢综合征患者可能是更合适的对照组。结果，当前的分析无法确定代谢变量对检测到的微生物特征的潜在混杂影响。但是，在临床实践中，招募年龄适中，年龄与我们的研究队列匹配，患有代谢综合征而没有NAFLD的对照组是具有挑战性的。实际上，该人群中存在代谢综合征，特别是糖尿病，大大增加了NAFLD，NAFLD纤维化和肝硬化的患病率；其次，非靶标代谢组学分析可以提供更多有价值的信息；最后，与饮食组成有关的详细信息将是有意义的，因为在NAFLD-HCC组中SCFA显著增加。

综上所述，我们已经确定了富含NAFLD-HCC的关键物种，具有功能和代谢组学证据表明SCFA合成增加，从而导致免疫抑制反应，而NAFLD肝硬化则未见。我们的数据支持以下观点：在HCC中利用微生物组及其代谢物的知识可能有助于开发预后指标和新的治疗策略（图8）。

图8 NAFLD-HCC患者的微生物组和代谢组在体内诱发了免疫抑制表型

总结关键发现的模式。NAFLD-HCC的生态失调的特点是不同的细菌种类的丰度增加，产生短链脂肪酸的能力增加和粪短链脂肪酸浓度升高。肝硬化伴肝细胞癌或不伴肝细胞癌的患者常出现“肠漏”。NAFLD-HCC患者的微生物组和代谢组在体外诱导了免疫抑制表型(特征为Tregs增加，CD8⁺T细胞减少，APCs减少)，这与HCC患者的临床结果不佳和免疫治疗耐药性有关。