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编译：微科盟萌依依，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。 微科盟原创微文，欢迎转发转载。 铜(Cu)作为一种生长促进剂、抗菌、抗真菌、抗寄生虫剂一直被广泛使用，已成为常见的环境污染物。因此，本研究探讨了对照组(10 mg/kg BW Cu)和治疗组(125 mg/kg.BW Cu和250 mg/kg.BW Cu) 三种不同实验处理80天的心脏毒性作用及其与猪心肌自噬和代谢组学过程的关系。血清生化指标结果表明，125 mg/kg.BW和250 mg/kg.BW Cu可显著提高血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶-MB(CK-MB)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)；同时在第80天，250 mg/kg Cu暴露后，心肌细胞出现严重的结构异常。此外，在实验第80天，250 mg/kg Cu可显著提高心肌细胞的mRNA和蛋白(Beclin1、ATG5和LC3-II)的表达水平，显著降低p62的表达水平。UPLC-QTOF/MS技术显示，250 mg/kg Cu处理后，心肌细胞内7种代谢物表达上调，37种代谢物表达下调，主要影响与自噬相关的甘油磷脂代谢、叶酸碳池、脂肪酸延长和脂肪酸降解等代谢途径。综上所述，本研究通过代谢组学和多种生物分析方法确定了Cu诱导的心肌损伤过程中的自噬过程和代谢途径中的代谢物，为Cu致心肌毒性提供了有用的证据。 论文ID 实验设计 实验结果 血清生化指标测定结果表明，125 mg/kg.BW和250 mg/kg.BW Cu可显著提高血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶-MB(CK-MB)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性(图1A-F)。结果表明，Cu处理组的仔猪血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶-MB(CK-MB)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性显著升高。与对照组相比，250 mg/kg Cu组的大鼠血清AST和HDL-C浓度在第40天显著升高(P<0.05)。试验第80天，随着饲粮中Cu水平的提高，血清中AST和HDL-C浓度显著升高(P<0.05)。Cu处理组仔猪血清CK-MB和LDL-C水平在试验第40天显著升高(P<0.05)，而Cu250 mg/kg组仔猪血清CK-MB和LDL-C水平在第80天差异不显著(P>0.05)。结果表明，125 mg/kg Cu组血清CK-MB和LDL-C水平显著高于对照组(P<0.05)。铜125 mg/kg和250 mg/kg组仔猪血清CK活性在试验第40天和第80天均显著高于对照组(P<0.05)。 在80天时，125 mg/kg Cu组和250 mg/kg Cu组与对照组相比，心肌铜含量显著升高(P<0.01，图S1)。组织病理学水平结果显示，猪心脏切片存在不同程度的组织病理学损伤。组织病理学水平结果显示，猪心脏切片存在不同程度的组织病理学损伤。与对照组相比，处理组(250 mg/kg Cu)心脏不同部位的组织学变化严重，包括细胞浸润、水肿、肌原纤维断裂、变性和心肌细胞坏死(图1G)。在实验第40天和第80天，猪心脏不同部位异色固缩核细胞的出现频率增加，而镜下观察心脏各部分心肌细胞坏死。组织病理学分析显示，与对照组相比，所有处理组在40天和80天都有特征性的病理改变，包括心肌细胞染色质物质的解体和溶解。这些显微变化在250 mg/kg Cu处理组(黑色箭头)更为明显。 图1 Cu对心肌肌酸激酶(CK)、肌酸激酶-MB(CK-MB)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、乳酸脱氢酶(LDH)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及Cu诱导的心肌（A-F）组织形态学的影响 用均值进行定量分析，“*”表示与对照组比较有显著性差异(*P<0.05或**P<0.01)。(G)心肌组织学改变。黑色单箭头表示心肌细胞核溶解(标尺为50μm)。 图2A和B显示了LC3-II经FITC染色呈绿色，经DAIP染色呈蓝色的阳性结果。绿色荧光主要分布在心肌细胞胞浆中，在实验第40天和第80天，随着Cu离子浓度的增加，绿色荧光强度明显增强。定量分析结果表明，与对照组相比，125 mg/kg和250 mg/kg Cu处理组的仔猪在试验第40天和80天的LC3-II阳性表达水平均显著升高(P<0.05)。 本研究采用免疫组织化学方法检测p62蛋白的表达，阳性表达呈胞浆棕黄色。结果表明，在第40天，125 mg/kg Cu组与对照组相比，棕色细胞增多，250 mg/kg Cu组棕色细胞减少(图2C)。此外，在试验的第80天，随着饲粮中Cu水平的增加，p62阳性表达水平显著增加。定量分析表明，与对照组相比，125 mg/kg Cu组p62阳性表达水平显著升高(P<0.05)，250 mg/kg Cu组p62阳性表达水平显著降低(P<0.05)。在实验第80天，125 mg/kg Cu和250 mg/kg Cu组与对照组相比，p62阳性细胞水平显著升高(P<0.05)。 图2 用免疫组织化学和免疫荧光法检测心肌组织中p62(隔离体-1)和LC3-II(微管相关蛋白轻链3-II)的表达 (A-B)采用免疫组织化学方法(比例尺为50μm)检测LC3-II的表达水平；(C)采用免疫组织化学方法(比例尺为50μm)检测p62的表达水平；(D)LC3-II和p62的表达水平具有统计学意义。用均值进行定量分析，“*”表示与对照组比较有显著性差异(*P<0.05或**P<0.01)。“#”表示两试验组间差异有统计学意义(#P<0.05，##P<0.01)。 自噬包括p62、Beclin1、ATG5和LC3-II等一系列基因和蛋白。结果表明，在试验第40天和第80天， 125 mg/kg和250 mg/kg Cu组仔猪Beclin1和LC3-II的mRNA和蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05,图3A-D)；在第80天，随着饲粮中Cu水平的提高，ATG5等mRNA的表达显著增加(P<0.05)，而125 mg/kg Cu处理组在试验40天时，ATG5的mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)；在试验第80天，125 mg/kg和250 mg/kg Cu处理组的p62蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)，而随着饲粮中Cu含量的增加，p62蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。 图3 自噬基因和蛋白在心肌中的表达 (A)心肌自噬蛋白p62、Beclin1、ATG5(自噬相关5)和LC3(微管相关蛋白轻链3)的mRNA表达。(2)热图显示自噬基因(p62、Beclin1、ATG5和LC3)在心肌中的相关表达。(C)自噬蛋白在心肌中的表达。(D)心肌自噬蛋白蛋白表达的定量分析。 通过对PCA中QC图的聚类，PCA和OPLS-DA结果显示出高重复性和低变异性(图2，图S1A-D)。250 mg/kg Cu组与对照组之间有显着差异，包括阳性模式和阴性模式，以VIP>1为标准筛选不同代谢物，P<0.05。结果显示，如图4A(热图)所示，共有44种(表S4-S5)差异代谢物(包括正离子和负离子)。在第80天，250 mg/kg Cu组与对照组相比，共增加了7种代谢物，减少了37种代谢物。 图4 代谢组学检测暴露于Cu的心肌中的差异代谢物和代谢途径 (A)热图显示心肌中的差异代谢物。(B)心肌代谢产物的通径分析。(C)与甘油磷脂代谢、单碳池、脂肪酸伸长和脂肪酸降解有关的不同代谢物的折叠变化。 5. Cu对心肌代谢途径的影响 对不同代谢物的结果我们用MetbraAnalyst4.0进行富集，pathway富集分析表明心脏毒性涉及到9条代谢途径(图4B)。在不同途径中，甘油磷脂代谢途径、叶酸碳池途径、脂肪酸延伸途径和脂肪酸降解途径是途径影响值最大的4条途径，分别是甘油磷脂代谢途径、叶酸碳池途径、脂肪酸延伸途径和脂肪酸降解途径。与对照组相比，250 mg/kg Cu处理组上述4条代谢途径的代谢产物中PC(20：5(5Z，8Z，11Z，14Z，17Z)/18：4(6Z，9Z，12Z，15Z))和PC(18：4(6Z，9Z，12Z，15Z)/20：4(5Z，8Z，11Z，14Z))明显增加。此外，(S)-3-羟基十六酰-辅酶A，PS(16：0/16：0)，1，4-二硫苏糖醇，3-(3，4-二羟基苯基)乳酸，β-甘油磷酸，吲哚乙酸，甲硫氨酸，甲氧氯乙胺，N-乙酰组胺，PC(22：5(4Z，7Z，10Z，13Z，16Z)/20：0)，巯基。250 mg/kg Cu处理组的巯基嘌呤和5，10-亚甲基-四氢呋喃均低于对照组(图4C)；心肌细胞的相关代谢变化如图5所示，结果表明甘油磷脂代谢是整个通道的中心枢纽，它不仅与脂肪酸代谢有关，而且还通过叶酸调节单碳池。这些结果表明，与对照组相比，250 mg/kg Cu处理使得大鼠脂质物质(吲哚乙酸和(S)-3-羟基十六酰-辅酶A)和磷脂相关物质(5，10-亚甲基-四氢呋喃(5，10-亚甲基-四氢呋喃和磷脂酰丝氨酸)显著下调，而磷脂乙醇胺显著上调。 图5 250 mg/kg Cu处理的大鼠心肌代谢变化示意图 每个方块代表一条主要的代谢途径。每个方框中的深蓝色标记字体代表关键代谢物。红色箭头表示250 mg/kg Cu组与对照组相比上调或下调。 讨论 Cu是生物体中的一种必需元素，其中饲料中的Cu可以促进动物有机体的生长；然而，Cu污染日益严重，可能对动物造成各种不利影响。急性过量暴露或长期暴露于Cu可能会损害心肌，甚至导致心力衰竭。在本研究中，与心肌损伤相关的生化指标的升高和组织学改变可以证实Cu对心脏的损伤作用；此外，有报道称自噬参与了Cu诱导的心肌损伤，然而，相应的信息不能完全描述Cu诱导的代谢反应和关键的代谢途径，其潜在毒性机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨Cu诱导心肌自噬过程中代谢途径的变化。 自噬是一种“自噬”，受多个基因调控，可调节自噬小体与溶酶体结合，最终维持细胞内的动态平衡。在自噬过程中，p62是一种关键蛋白，在自噬途径中起重要作用，并导致自噬底物之间的联系；然后，通过化合物的作用将LC3转移到LC3-I，LC3-II随后被切割，并通过ATG的作用释放LC3。此外，ATG5是自噬的主要蛋白，参与自噬前体的扩张和完成，而beclin1也是自噬的重要调节因子，可能通过诱导相关蛋白的表达来促进自噬的形成。在本研究中，LC3-II、ATG5和beclin1的mRNA和蛋白表达水平随着Cu暴露水平的增加而升高。结果表明，p62在实验早期随Cu水平的升高而升高，在第40天时随Cu水平的升高而降低。在我们的实验研究中，p62、LC3-II、ATG5和beclin1的mRNA和蛋白表达水平在实验第80天随着Cu暴露水平的增加而增加。我们的实验研究结果证实，Cu的增加会引起心肌细胞自噬过程的异常。 此外，我们的研究结果还表明，250 mg/kg Cu暴露的猪与对照组相比，在代谢谱上表现出明显的差异，如主成分分析、PLSDA分析、堆图分析和系统聚类分析。我们共鉴定出44种差异代谢物，它们在脂类代谢、氨基酸代谢等多个途径上表现出紧密的校正。在高Cu环境下，脂肪代谢途径如甘油磷脂代谢、脂肪酸伸长和脂肪酸降解等发生了显著变化；脂质及其衍生物花生四烯酸、亚油酸和α-亚油酸是重要的细胞膜结构，在调节细胞增殖和自噬等多条信号转导通路中发挥重要作用。在所检测的脂质中，Cu处理显著提高了磷脂酰乙醇胺(PE)的水平，而磷脂酰丝氨酸(PS)和脂肪酸的水平则发生了显著的变化。PS可以通过一系列转化转化为PE，PS和PE是细胞膜的主要成分。PE作为自噬相关蛋白LC3的自噬体膜的锚，可以诱导自噬的表达；脂肪酸是一种重要的能量物质，可引起线粒体能量代谢紊乱，导致大量ROS，导致细胞自噬，我们的结果与这一观点完全一致。本研究结果表明，过量Cu暴露可显著上调心肌细胞PE水平，下调PS和脂肪酸水平，从而导致脂质代谢紊乱，从而诱导心肌细胞自噬。 在本研究中，氨基酸代谢也是一条主要的差异代谢途径。与对照组相比，过量Cu处理组的大鼠体内色氨酸、苏氨酸、丝氨酸和甘氨酸代谢途径水平发生了显著变化。先前的研究表明，苏氨酸、甘氨酸和丝氨酸可以扰乱线粒体膜电位、线粒体膜通透性以及线粒体的合成和切割过程，并可以促进细胞内的自噬。众所周知，Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径参与自噬过程，苏氨酸、甘氨酸和丝氨酸参与自噬过程中PI3K活性的调节。我们的研究表明，经Cu处理后，5，10-亚甲基-天冬氨酸显著降低，并导致心肌苏氨酸、甘氨酸和丝氨酸代谢紊乱；同时，色氨酸代谢在自噬过程中起主要作用。色氨酸是线粒体能量代谢中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的主要合成途径，色氨酸代谢障碍可能影响线粒体功能异常和ATP合成受损，导致自噬相关蛋白表达升高。有证据表明，氨基酸代谢可能会促进自噬水平，这与之前的研究完全相同。在本研究中，经Cu治疗后，吲哚乙酸显著降低，并引起心肌色氨酸代谢紊乱，这些结果暗示，Cu可引起心肌色氨酸代谢紊乱，进而导致自噬。总体而言，代谢组学技术对代谢差异代谢途径的分析表明，代谢产物的破坏可以诱导细胞自噬。 在这项研究中，我们确定了Cu暴露对心肌自噬的潜在影响。Cu暴露使自噬相关蛋白和基因(p62、ATG5、Beclin1和LC3-II)水平显著升高，暗示Cu暴露促进了自噬。代谢组学结果表明，暴露于Cu可以扰乱正常的脂质和氨基酸代谢，总之，Cu对心肌损伤的机制是破坏了体内脂质和氨基酸代谢，从而诱导自噬。 结论 综上所述，过量的铜暴露可诱导心肌细胞自噬。我们进一步利用代谢组学技术对铜诱导的心肌自噬作用进行了研究，铜诱导心肌毒性的机制涉及不同的代谢途径。甘油磷脂代谢、单碳池的叶酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、脂肪酸伸长和脂肪酸降解可能与铜诱导的自噬密切相关。因此，代谢组学作为最能反映表型的方法，在探讨铜暴露的心肌响应机制方面是有效的。 |
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