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编译：思越，编辑：景行、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 转移性结直肠癌的免疫治疗仅对具有高微卫星不稳定性的错配修复缺陷肿瘤有效，并表现出免疫浸润，这表明肿瘤细胞可以决定其免疫微环境。为了理解这一关系，本研究分析了来自23个韩国人和6个比利时人的91103个未分类的单细胞的转录组数据，对结直肠癌细胞，以及细胞间相互作用的进行研究，揭示了癌细胞与免疫细胞、基质细胞的联系，为设计有效的免疫肿瘤治疗策略提供了机制依据。 论文ID 原名：Lineage-dependent gene expression programs influence the immune landscape of colorectal cancer 译名：细胞谱系依赖性基因表达程序对结直肠癌中免疫景观的影响 期刊：Nature Genetics IF：27.603 发表时间：2020年6月 通讯作者：Sabine Tejpar & Woong-Yang Park 通讯作者单位：成均馆大学三星健康科学与技术高级研究所 & 比利时鲁汶大学 DOI号：10.1038/s41588-020-0636-z 实验设计 结果 1 结直肠癌中全局细胞景观 为了阐明结直肠癌中细胞类型，在本研究共分析了三星医学中心(SMC)的23名韩国CRC患者、以及鲁汶大学(KUL3)的6名比利时CRC患者的91103个CRC单细胞(图1a)。进行RCA和CCA聚类分析后，使用marker基因对所有单细胞进行注释，在SMC和KUL3中注释了6中主要的细胞类型(图1b-c)：上皮细胞、成纤维细胞/内皮细胞、髓系细胞、T/NK/NK T淋巴细胞、B淋巴细胞/浆细胞、肥大细胞。 根据肿瘤组织的分子亚型以及遗传和临床信息，对每个CRC患者的细胞类型进行分类(图1b-c)。与正常组织相比，在肿瘤组织中观察到髓系细胞总体增加、B细胞数量总体减少，提示免疫应答被重定向，表明了在癌症发展过程中免疫反应经历动态变化的过程。在SMC中，发现CMS亚组之间的细胞比例存在差异，与CMS1和CMS4肿瘤相比，CMS2和CMS3肿瘤的免疫和基质细胞比例降低(图1b)，并通过bulk RNA-seq表明CMS2和CMS3肿瘤中免疫细胞含量降低(图1d)，与之前报道的CMS2 CMS3属于免疫冷亚型一致。 图1. RCA和CCA联合应用识别结直肠癌中细胞类型A.样本收集和单细胞转录组分析的工作流程B.SMC和C.KUL3中的t-SNE图(左上)，CRC组织和正常黏膜中细胞类型占比(左下、右图)D.使用ESTIMATE算法计算23个bulk RNA-seq的基质得分，免疫得分和肿瘤纯度。 2 单细胞CMS特征 先前研究发现，人类结肠癌细胞也具有正常结肠上皮细胞的多系分化过程。SMC数据集中，对正常上皮细胞进行亚型分析显示其存在不同的分化状态，包括干细胞样/运输扩增细胞、结直肠细胞、杯状细胞(图2a)，KUL3数据集也表现出类似的分化多样性，并通过迹分析表明分化起源于干细胞样/运输扩增细胞，并向结肠细胞或者杯状细胞分支。肿瘤细胞的分化轨迹与正常上皮细胞的分化轨迹类似，具有正常干细胞样/转运扩增细胞群的肿瘤细胞聚集(图2b)，说明肿瘤上皮细胞具有再生和增殖潜力。 为了针对性探究肿瘤细胞的转录程序，研究者将肿瘤上皮细胞进行聚类分析，结果显示，许多肿瘤细胞形成了病人特异的簇，这表明与正常细胞相比肿瘤上皮细胞在每个患者中具有高度可变的转录状态。为了消除肿瘤上皮细胞的个体差异，找到共同的转录组特征，使用Monocle v.2的反向图形嵌入技术重建了一个无监督肿瘤细胞的轨迹。轨迹揭示了一个转录层次结构，定义了9种分子状态，并汇聚成两个离散的转录组集(图2c)。一类高富集转运和Wnt信号基因的表达(FABP1，ID1，ID3，OLFM4和ASCL2)，另一类为分泌和迁移基因的表达(TFF1，TFF2，TFF3，SPINK4和AGR2)。这些转录特征映了结直肠癌中的CMS(图2d)，在单细胞中CMS2 CMS3的样本被投影到了肿瘤上皮细胞的分化轨迹中，而BUKL测序数据中为CMS1 CMS4(图2c)，提示肿瘤上皮细胞对CMS2 CMS3亚型的贡献较大，而成纤维细胞和免疫细胞对CMS1 CMS4的贡献较大。 通过计算每个样本中CMS样的单细胞比例，发现患者主要以CMS2样细胞主导以及由CMS1样和CMS3样细胞主导(图2d)。CMS1样和CMS3样细胞共表达不同水平的CMS1免疫基因和CMS3分泌上皮特征基因，提示两个亚群之间存在密切关系。CMS1样肿瘤细胞在大部分的CMS1组织中占主导地位，提示肿瘤或非肿瘤成分驱动的两种不同的免疫细胞激活模式。此外，单细胞CMS模式与解剖区域、微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变谱有关(图2e)，CMS2样细胞主导的样本与TP53和APC共突变有关，CMS1样和CMS3样主导的样本与KRAS和BRAF基因突变相关。但是，发现很少有CMS4样肿瘤细胞，即使是来自CMS4组织(图2c)。在分析细胞类型对各组织分子亚群的影响时，发现上皮肿瘤细胞与CMS4基因呈负相关，基质细胞(包括成纤维细胞和内皮细胞)正相关最高(图2f)，并与转化生长因子-β(TGF-β)相关。此外，CMS中个别患者的肿瘤细胞表现出不同的瘤内异质性，以及增殖、干细胞特性、缺氧和化疗耐药等与癌症相关的信号。总之，本研究分析表明，由于肿瘤微环境与肿瘤内异质性引起的转录活动调节等谱系相关致癌事件呈现出功能多样化和环境适应的现象。 3 基质细胞动力学支持肿瘤生长 在基质细胞亚群中，成纤维细胞和内皮细胞是主要的细胞类型。另外，周皮细胞、血管平滑肌细胞和肠胶质细胞被确定为次要的基质细胞类型(图3a)。周细胞的特征是收缩基因(TAGLN、ACTA2)和RGS5共表达；血管平滑肌细胞的特征是收缩和细胞骨架基因表达基因表达(TAGLN、ACTA2、MYH11、SYNPO2、CNN1和DES)；肠胶质细胞的的特征是SOX10， S100B和PLP1基因表达(图3b)。 成纤维细胞亚群通过COL3A1、DCN和THY1的表达来定义，在正常粘膜中，间质成纤维细胞的类型分别为S1， S2和S3。S2成纤维细胞位于上皮单层附近，表达BMP和Wnt通路基因以支持上皮祖细胞的增殖和功能。而在癌症组织中，主要为肌成纤维细胞(图3b)。肌成纤维细胞在CMS1和CMS4组织中最显著(图3a，c)，说明不同亚型中基因表达是异质的(图3b，d)。根据差异表达基因可细分为MF1-4组。MF1富集于细胞外基质合成，MF2富集于细胞外基质降解和炎症趋化因子，MF3的RGS5提示起源于周细胞， MF4用于具有mf2类特性的增殖。所有肌成纤维细胞簇均高表达Wnt信号基因，如POSTN和WNT5A(图3b)。这些结果表明，肌成纤维细胞通过广泛的组织重塑刺激肿瘤生长，并通过Wnt信号支持癌症干细胞存活。 内皮细胞簇以ENG和PECAM1基因表达为特征，并且无成纤维细胞特征(图3a，b)。研究者将八个内皮细胞簇分为四种内皮细胞类型，包括尖端细胞和柄细胞。在肿瘤和正常样本中都发现了其中一个亚群：淋巴管内皮细胞(类17，图3a-b)。血管内皮细胞簇包括尖状和柄状内皮细胞，其中大多是肿瘤(类6，8)或正常结肠来源的(类9，14，15)。值得注意的是，比较正常和肿瘤组织之间的尖端和柄细胞类型，发现肿瘤中“血管生成调节因子”过多，而在正常粘膜中“抗原处理和呈递因子”过多(图3e)。此外，还发现一个高增殖细胞群，，表现为过表达生存素(BIRC5)和CKS1B，作为单独的肿瘤来源集群。之前的研究认为这些基因与内皮细胞凋亡抑制和增殖相关。在结肠癌中，内皮细胞的高血管生成特性反映了新生血管的激活，抗原呈递血管内皮细胞数量不足提示免疫刺激减弱(图3e)，ICAM1基因表达的下调也支持CRC中内皮成分的免疫衰减。 图3. 正常黏膜和CRC组织中的基质细胞动力学。A.SMC数据集的基质细胞的t-SNE图，肿瘤组织和正常黏膜中细胞数量和亚细胞类型比例B.成纤维细胞和内皮细胞的谱系标记基因热图C.不同CMS类下成纤维细胞亚群比例及平均细胞数D.肌成纤维细胞上每个簇的前5个DEGE.内皮细胞的分层聚类热图。 4 从粘膜免疫向抑制细胞免疫的转变 在CRC组织中，髓系扩张表明其在塑造肿瘤微环境中发挥积极作用。通过亚聚类分析将髓细胞分为巨噬细胞和树突状细胞(图4a-b)。巨噬细胞簇包括促炎和抗炎亚群(图4a-c)，树突状细胞簇为传统树突状细胞，高度表达CD1C和FCER1A.与KUL3患者相比，SMC患者的正常粘膜中发现了极少的髓细胞，并在两个数据集中发现了相似的髓细胞类型(图4a-b)。 肿瘤组织中的巨噬细胞呈混合表型，表达促炎和抗炎基因(图4c)。特别的是，渗出型焦磷酸蛋白1(SPP1+)巨噬细胞在肿瘤核心和边缘富集。脂多糖，一氧化氮，γ干扰素和白介素-1β等促炎分子可诱导SPP1基因表达，产生骨桥蛋白。SPP1+巨噬细胞还表达与抗炎表型有关的载脂蛋白E (APOE)，说明SPP1+巨噬细胞的显著扩张可能通过骨桥蛋白在免疫抑制和肿瘤进展中发挥核心作用。此外，SPP1+巨噬细胞在CMS1型和CMS4型患者中增加(图4c)，并通过TCGA的COAD和READ队列验证(图4d)。此外，SPP1+表达水平高的患者预后较差(图4d)，这反映了扩张的SPP1+巨噬细胞集群在CRC中的临床影响。 在正常黏膜和CRC组织中，T淋巴细胞是最大的免疫细胞群。SMC数据集中的20个T细胞亚群代表来自CD4+，CD8+，γδT细胞和NK细胞的不同的T细胞亚群(图5a)。CD4+和CD8+T细胞簇都包含几个亚簇，代表从初始状态到激活或衰竭状态的过渡。研究者分别标记了来自其他CD4+ T细胞簇的调节性(Treg)和T辅助性17 (Th17)亚群。发现T细胞亚型在正常组织和肿瘤组织中分布不均：Th17和Treg细胞主要分布于肿瘤组织，正常粘膜中γδT细胞较为丰富(图5a-b)。当评估与MSI状态相关的免疫细胞组成作为免疫检查点抑制剂阳性反应的替代标志物时，发现在SMC数据中，MSI-H样本在高Treg人群和低Th17人群中富集(图5b，c)。还通过对细胞毒性和衰竭进行评分来评估CD8+T细胞亚群的功能状态，肿瘤组织中CD8+T细胞的细胞毒性和耗竭评分高于正常粘膜中的评分(图5d)。 在SMC数据集的B细胞簇中，发现了卵泡B细胞和浆细胞，并在CRC组织中，发现卵泡B/浆细胞显著减少以及不同抗体同型表达(图5e)，且大多数轻链特异性浆细胞中，IGHA的表达减少和IGHG的表达增加，提示免疫微环境发生了系统性变化。在KUL3数据集中，在肿瘤的核心和边缘观察到IGHA浆细胞的整体收缩，但在肿瘤核心的IGHG基因表达转移更为明显。 5 CMS特异性细胞互作网络 为了对细胞动力学的改变进行统计学评估，对25种细胞亚型的正常组织相对肿瘤组织在CMS分组、 MSI-H分组、解剖位置进行卡方检验(图6a)，发现肌成纤维细胞，巨噬细胞，CD8+ T细胞，Treg细胞，Th17细胞和免疫球蛋白G(IgG+)浆细胞在肿瘤组织中富集，而基质成纤维细胞、CD4+ T细胞、γδ T 细胞和IgA+浆细胞在正常黏膜中富集。CRC细胞景观在不同的CMS、MSI-H状态和解剖区域下不同，在CMS1肿瘤中，包括大多数MSI-H样本，Treg细胞显著富集，而肌成纤维细胞和促炎/SPP1+巨噬细胞在CMS4肿瘤中最为显著。 为了了解不同细胞群之间的相互作用，以及它们如何共同组成结直肠肿瘤微环境，基于受体配体数据库(receptor–ligand)推断出了一个假定的细胞相互作用网络。在正常黏膜中，IgA+浆细胞和CD4+ T细胞周围形成相互作用最强的节点，表明粘膜抗体反应的激活。CRC组织中的IgA网络减少，但肿瘤细胞周围出现了新的相互作用边，连接到肌成纤维细胞、SPP1+巨噬细胞、CD8+ T细胞和Treg细胞。此外，我们在不同CMS组织亚型下分析CRC细胞网络，以适应肿瘤微环境的总体差异。在CMS1和CMS4中，前20个预测的相互作用主要涉及非肿瘤细胞类型，如CMS1的Treg细胞或肌成纤维细胞和CMS4肿瘤的SPP1+巨噬细胞。CMS2和CMS3组织中，前20个预测的相互作用发生在肿瘤和非肿瘤细胞类型之间，说明肿瘤细胞在塑造肿瘤微环境中的主导作用。 在特异性受体-配体对的分子重构中，估计了CMS4肿瘤中显著的SPP1-CD44和TGFB1-TGFBR相互作用(图6b)，这些分子相互作用在免疫抑制和促进转移的肿瘤微环境中至关重要。总之，全面的细胞景观和相互作用网络揭示了CRC的分子特征，谱系相关的遗传改变以及基质和免疫中肿瘤驱动的改变(图6c)。 图6. CRC中不同CMS分类下分子互作网络的差异重编程。A.肿瘤与正常组织之间的细胞动力学变化，并根据CMS亚型、MSI状态和解剖位置对肿瘤分组比较 B.使用CellPhoneDB推断每个样品的受体-配体相互作用 C.CRC中由于微环境因素导致的肿瘤发生和信号放大作用引起的遗传改变示意图。 总结 有关CRC的单细胞转录组研究，发现的特定细胞类型十分有限。本工作分析了来自23个韩国人和6个比利时人的91103个未分类的单细胞的转录组数据，对样本进行共识分子亚型(CMS)分类，分析总样本以及各自分类中细胞的关系，研究了样本的分化途径和转录程序，同时发现单细胞CMS模式与解剖区域、微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变谱相关。基质细胞动力学研究发现，肌成纤维细胞通过广泛的组织重塑刺激肿瘤生长。随后分析了正常黏膜和CRC组织中免疫细胞的分布差异。最后重建了细胞间互作网络，研究了癌细胞特征和特定基质或免疫细胞群之间的联系。该工作中对结直肠癌细胞景观和细胞间相互作用的观点为设计有效的免疫肿瘤治疗策略提供了机制信息。 更多推荐 1 科研 | 阿德福韦酯通过干扰KCTD12-CDK1相互作用使结肠癌细胞对维罗非尼敏感（国人佳作）  END |
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