nucmer全基因组序列比对

菌心说 2021-05-06

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1. MUMmer简介

MUMmer（Maximal Unique Match mer）软件中使用率最高的命令nucmer能用于对两个基因组assemblies进行比较。现在最新版本的MUMmer4相比于MUMmer3，能用于更大的基因组序列比较，运行速度更快。

2. MUMmer4软件安装

先安装高版本autoconf、automake和yaggo

wget http://ftp./gnu/autoconf/autoconf-2.69.tar.gz -P ~/software_packages/
tar zxf ~/software_packages/autoconf-2.69.tar.gz
cd autoconf-2.69
./configure --prefix=/opt/sysoft/autoconf-2.69
make -j 24 && make install
echo 'PATH=/opt/sysoft/autoconf-2.69/bin/:$PATH' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc
cd .. && rm -rf autoconf-2.69

wget http://ftp./gnu/automake/automake-1.16.tar.gz -P ~/software_packages/
tar zxf ~/software_packages/automake-1.16.tar.gz
cd automake-1.16
./configure --prefix=/opt/sysoft/automake-1.16
make -j 24 && make install
echo 'PATH=/opt/sysoft/automake-1.16/bin/:$PATH' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc
cd .. && rm -rf automake-1.16

wget https://github.com/gmarcais/yaggo/releases/download/v1.5.10/yaggo-1.5.10.tgz -P ~/software_packages/
tar zxf ~/software_packages/yaggo-1.5.10.tgz -C /opt/sysoft/
make
echo 'PATH=/opt/sysoft/yaggo-1.5.10:$PATH' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc

再安装MUMmer4

$ wget https://github.com/mummer4/mummer/archive/v4.0.0beta2.tar.gz -O -P ~/software_packages/mummer-4.0.0beta2.tar.gz
tar zxf ~/software_packages/mummer-4.0.0beta2.tar.gz
cd mummer-4.0.0beta2
autoreconf -fi
./configure --prefix=/opt/biosoft/mummer-4.0.0beta2
source ~/.bashrc.gcc    要使用高版本GCC进行编译
make -j 24 && make install
cp -r MANUAL.md docs /opt/biosoft/mummer-4.0.0beta2/
cd .. && rm -rf mummer-4.0.0beta2
cd /opt/biosoft/mummer-4.0.0beta2/docs/
latex maxmat3man.tex
dvipdf maxmat3man.dvi
echo 'PATH=$PATH:/opt/biosoft/mummer-4.0.0beta2/bin/' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc

若需要使用MUMmer调用gunplot绘图，则需要安装高版本的gunplot

wget https:///projects/gnuplot/files/gnuplot/5.2.2/gnuplot-5.2.2.tar.gz -P ~/software_packages/
tar zxf ~/software_packages/gnuplot-5.2.2.tar.gz 
cd gnuplot-5.2.2
./configure --prefix=/opt/sysoft/gnuplot-5.2.2 && make -j 24 && make install
cd .. && rm -rf gnuplot-5.2.2
echo 'PATH=/opt/sysoft/gnuplot-5.2.2/bin/:$PATH' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc

3. mumer命令

mummer命令是MUMmer软件的核心程序。其它程序，如nucmer就是perl编写的调用此核心程序进行数据分析的脚本。由于该程序是核心程序，MUMmer软件给出了该命令的详细说明文档。

mummer命令用于计算query assembly和reference assembly中>=20bp的匹配序列（maximal matches），该段maximal matches序列在query和reference基因组序列中完全一致，且延长到最长。

mumer命令的使用：

mumer用法
$ mummer [options] <ref.fasta> <query1.fasta> [query2.fasta] ...
    mummer只能输入一个reference assembly文件，最多支持输入32个query 
assembly文件。程序将结果输出到标准输出。
常用示例：
$ mummer -mumreference -l 20 -b -n -c -F ref.fa query.fa > out.txt

常用参数：
-mum
-mumreference
-maxmatch
    mummer程序用于计算获得maximal matches。程序通过suffix array算法将
reference assembly构建索引数据库，然后再将query assembly和数据库比对，
搜索并得到maximal matches。
    有很多maximal matches可能属于重复序列，而重复序列的比对可能没太大意义，
且重复序列的比对极大消耗计算量。因此，需要考虑是否需要得到重复序列的比对结果。
    以上3个参数则对应重复序列的处理方法：默认是-mumreference参数，表示构建
数据库时，去掉了reference assemly中的重复序列，得到的结果中，maximal 
matches在reference assembly中是unique的，这种方法计算速度最快；-mum参数
则是在前者基础上，对query assembly先去除重复序列，再进行比对，得到的结果中，
maximal matches在reference assembly和query assembly中都是unique的，
这种方法计算速度较慢；-maxmatch参数则完全不考虑重复序列，该方法计算速度最慢，
同时生成的结果文件非常大。

-l <int>    default: 20
    设置maximal match的最小长度。

-b
-r
    默认设置下，mummer进行maximal matches搜索时，要求query和reference
上的maximal matches序列完全一致；若加上-r参数，则要求query和reference
上的maximal matches序列反向互补；若加上-b参数，则以上两种情况都考虑。

-n
    mummer对query和reference序列进行比较时，能识别任意字符，且对字符大小写
不敏感，因此，也适合于蛋白序列的比较。若加入该参数，则仅识别ATCG四种碱基字符，
所有其他字符都认为是不能匹配的。适合于assembly中含有W/Y/N等简并碱基的情况。

-c
    若加入参数-b或-r，则会考虑maximal matches序列反向互补匹配的情况。这时，
mummer将query序列转换成反向互补序列，在输出文件中，>一行后面有reverse字样，
其结果中第三列的值也是该反向互补序列的比对位点，表示query反向互补序列从该位点
开始往后是maximal matches序列；若加入-c参数，则将第三列的值转换成query序列
的位点（query序列长度 - 第三列值 + 1），表示从该位点往前是maximal matches
序列。

-F
    程序默认设置下，一般会生成4列数据，第一列表示reference的序列ID，若
reference序列仅有一条，则不会给出该列数据。加入该参数，则强制性给出该列
数据。

mummer命令的结果解读：

1. 结果中>开头行表示某条query序列，之后的行表示该条query序列的详细比对结果；
若该行有reverse，则表示该query序列的反向互补序列的结果。
2. 第一列是reference序列ID；第二列表示reference起始位点；第三列表示query
序列或其反向互补序列的起始位点；第四列表示maximal matches序列长度。

对一段3000bp的序列作为reference序列，对其841-1800区段进行反向互补后，作为
query序列

1. 不加 -b 参数，则不会对query序列反向互补序列进行分析
$ mummer -n -F ref.fa query.fa
> query_seq
  ref_seq         1         1       840
  ref_seq      1801      1801      1140

2. 加 -b 不加 -c 参数，额外给出反向互补序列的结果
$ mummer -b -n -F ref.fa query.fa
> query_seq
  ref_seq         1         1       840
  ref_seq      1801      1801      1140
> query_seq Reverse
  ref_seq       841      1141       960
注意 Reverse 表示反向互补结果，query反向互补序列从其1141位点往后共960bp属于
maximal match。

3. 加 -b 和 -c 参数
$ mummer -b -c -n -F ref.fa query.fa
> query_seq
  ref_seq         1         1       840
  ref_seq      1801      1801      1140
> query_seq Reverse
  ref_seq       841      1800       960

注意 Reverse 表示反向互补结果，query序列从其1800位点往前960bp属于maximal 
match。

4. nucmer命令

nucmer命令用于对nucleotide序列进行比对。相比于mummer命令，nucmer命令能将相邻的maximal matches连起来作为cluster，然后对cluster两端进行延伸，形成大的匹配区域；并且计算SNP数量和INDEL间的距离。

nucmer命令是MUMmer软件使用最多的命令，常用于相似性很高的核酸序列比较，特别是通一
个物种间的基因组序列比较，或不同De novo组装软件得到的assemblies之间的比较。

nucmer命令的使用：

用法和常用示例：
$ nucmer [options] ref:path query:path

$ nucmer -c 200 -g 200 ref.fa query.fa
常用参数：
-p <string>    default: out
    设置输出文件前缀。
--num
--mumreference
--maxmatch
    mummer程序用于计算获得maximal matches。程序通过suffix array算法将
reference assembly构建索引数据库，然后再将query assembly和数据库比对，
搜索并得到maximal matches。
    有很多maximal matches可能属于重复序列，而重复序列的比对可能没太大意义，
且重复序列的比对极大消耗计算量。因此，需要考虑是否需要得到重复序列的比对结果。
    以上3个参数则对应重复序列的处理方法：默认是-mumreference参数，表示构建
数据库时，去掉了reference assemly中的重复序列，得到的结果中，maximal 
matches在reference assembly中是unique的，这种方法计算速度最快；-mum参数
则是在前者基础上，对query assembly先去除重复序列，再进行比对，得到的结果中，
maximal matches在reference assembly和query assembly中都是unique的，
这种方法计算速度较慢；-maxmatch参数则完全不考虑重复序列，该方法计算速度最慢，
同时生成的结果文件非常大。
    nucmer命令调用mummer程序进行计算，沿用了以上3个参数，只是参数的使用由
一个中划线变成了两个中划线。
    若比较两个基因组，希望得到更大的比对区域，则考虑使用--maxmatch参数；若
想整合两个assemblies，则最好不对重复序列进行比对，考虑使用--mumreference
参数。

-f | --forward
-r | --reverse
    默认设置下，程序对正负链都进行比对；加入-f参数则仅对正链进行比对；加入-r
参数则仅对负链进行比对。

-l <int>    default: 20
    设置maximal match的最小长度。

-g <int>    default: 90
    将两个相邻的maximal matches连起来，作为一个cluster，要求这两个matches
之间的距离不超过该参数指定的碱基数。

-c <int>    default: 65
    一个cluster中所有maximal matches的长度总和要不小于该参数值。

-d <float>    default: .12
-D <int>    default: 5
    若cluster中相邻的两个maximal matches和中间Gap区段中，变异的碱基比率
要低于-d参数值；变异的个数要少于-D参数值。
--extend
--noextend
    设置是否对clustering两端进行延伸。默认设置是--extend。

-b <int>    default: 200
    对cluster两端进行延伸（cluster侧翼存在一定长度的匹配区域）时，不能跨越
长度超过200bp的低匹配得分区域。

-t | --threads <int>    
    设置程序运行所使用的线程数。默认值是使用计算机所有CPU线程数。nucmer多
线程效率不高：例如，80线程服务器运行一个nucmer命令，平均负载不到40，真实的
CPU线程资源消耗不到20。

--save <string>
    加入该参数，则能生成reference序列的索引数据库，该参数值是生成的索引数
据库文件前缀。

--load <string>
    输入reference索引数据库前缀。使用前一个参数和此参数，在多次利用nucmer
命令进行分析时，能节约计算时间。

nucmer程序输出文件为out.delta。该文件示例内容：

/home/username/reference.fasta /home/username/query.fasta
NUCMER
>ref_seq1 query_seq1 500 2000000
88 198 1641558 1641668 0 0 0
0
167 4877 1 4714 15 15 0
2456
1
-11
769
950
1
1
-142
-1
0
>ref_seq2 query_seq4 50000 30000
5198 22885 5389 23089 18 18 0
-6
-32
-1
-1
-1
7
1130
0

out.delta文件格式解析：

1. 文件第一行是两个需要比较的基因组序列fasta文件的绝对路径。
2. 第二行是比对类型，可以是NUCMER或PROMER。
3. 第三行往后是比对结果。每个比对结果以行首为 > 号开头，整行为 0 结尾。
4. 比对结果第一行以 > 号开头，后面包含空格分割的4列，分别是：reference序列
   ID、query序列ID、该reference序列长度、该query序列长度。
5. 比对结果第二行包含空格分割的7列数值，分别是：reference序列比对起始位点、
   reference序列比对结束位点、query序列比对起始位点、query序列比对结束位
   点、错配位点数、不相似位点数（在蛋白序列比对中有意义，核酸序列比对中和前
   一个数值一致）、非字母字符个数（在蛋白序列比对中表示终止密码子个数，在核
   酸序列比对中一般是0）
6. 第三行往后是Delta值，表示离下一个IDNEL之间的距离，正数表示在reference
   中是Inserion，负数表示在reference中是Deletion。最后一行是0。
   例如： reference  acg.tagctgag$
             query  .cggtag.tgag$
   Delta = (1, -3, 4, 0)。

参考：
http://www./?p=2559