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上期关于氢气和自由基的文章发出后有两个问题大家比较关心。一是有很多论文基于日本学者提出的氢气“选择性抗氧化”假说发表，否定“选择性抗氧化”是否意味着对氢气的否定？这是一种误解，已经发表的众多论文关于功能方面的研究我没有异议，多数文章也只是引用了“选择性抗氧化”假说来解释研究结果。我认可氢气具有重要的生物学功能，这一点毋庸置疑，但是对于解释氢气为什么有这么多功能我有不同意见。机理的问题虽然难但非常重要，也是氢气生物学前行的主要制约因素之一，是我们不得不面对的。二是为什么对生物酶这么关心？生命之所以为生命是离不开生物酶的。生物酶绝大多数是蛋白质，一个典型的真核细胞能够催化数千种不同的反应，下边的图中可以看出是非常复杂的。生物化学反应和普通化学反应的最大区别是多数生化反应是在酶的催化下高效、高选择性地进行，反应条件温和可控（37℃左右生理体温）。细胞代谢途径的简化图。每个点代表一个中间化合物，每个连接线代表一个酶促反应。 举一个例子，我们的生命系统需要利用来自环境的能量，蔗糖可以作为人体的能量来源，一袋糖可以在货架上存放多年，也不会转化为二氧化碳和水，虽然这一化学过程在热力学上是有利的，但它非常缓慢。然而，当人类（或几乎任何其他生物）消耗蔗糖时，它会在几秒钟内释放出化学能。区别就在于生物体内酶的催化作用。没有催化作用，糖的氧化等化学反应就不能在一个有用的时间尺度上发生，因此无法维持生命。 乙酰胆碱酯酶（AChE）和辣根过氧化物酶（HRP)分别是两类结构相关的重要生物酶家族的代表。氢气的生物学机理，AChE和HRP可能不是最重要的，却是重要的一环。 辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）是以铁卟啉为辅基的血红素蛋白，同类蛋白包括细胞色素氧化酶、过氧化物酶、细胞色素P450超家族、一氧化氮合酶等众多重要的生物酶（Poulos，2014）。金属卟啉广泛存在于整个生物圈，其中血红素（铁原卟啉IX）是最丰富和应用最广泛的一种。血红素是是原卟啉IX与铁的络合物，原卟啉IX是由4个吡咯环组成，4个吡咯环通过甲叉桥连接成四吡咯环系统。
原卟啉IX的结构。 血红素是血红蛋白的辅基，也是肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶、过氧化氢酶等的辅基。细胞色素是一类以铁卟啉作为辅基的电子传递蛋白，可以在线粒体呼吸链的蛋白质之间运输电子，广泛参与动、植物，酵母以及好氧菌、厌氧光合菌等的氧化还原反应。细胞色素作为电子载体传递电子的方式是通过其血红素辅基中铁原子的还原态(Fe2+)和氧化态（Fe3+）之间的可逆变化。血红素在血红蛋白则可以参与氧气的运输和储存。细胞色素c氧化酶血红素中心的结构（Poulos，2014）血红素酶既可以催化氧化反应也可以催化还原反应。血红素氧化酶有两大类：一是利用O2氧化底物（通常是氧合物）的加氧酶（oxygenases），二是利用H2O2氧化底物（通常不是氧合物）的过氧化物酶（peroxidases）。在这两种氧化剂中，分子氧是最不寻常的，因为即使生物分子被O2氧化是热力学上有利的过程，但由于O2是顺磁性分子，这些反应有很大的动力学障碍,为了克服这一障碍氧合酶招募过渡金属和血红素进入酶活性位点。如图所示，血红素氧合酶结合O2并将O2的氧化当量储存在铁、卟啉和/或氨基酸侧链中以进一步选择性氧化底物。过氧化物酶使用H2O2作为氧化剂，虽然没有O2自旋屏障，但H2O2也有自己的问题，过氧化氢和过渡金属之间的芬顿反应会产生有毒的羟基自由基，这将对酶的活性部位造成高度破坏。血红素酶激活氧和过氧化氢（Poulos，2014） 氧合酶（Oxgenases）必须使铁还原为亚铁（Fe（II）或Fe2+），然后O2才能结合。氧络合物（Fe（III）-OO-）经第二次电子转移导致超氧物减少到过氧化物水平。远端的O原子必须质子化，以确保O-O键的异裂，从而导致水的离开，留下一个只有6个价电子的O原子。氧化当量的重排在酶的活性中心产生活性氧化剂，通常称为复合物I。 所有血红素氧合酶都在过氧化物酶催化环的某个点上。分子氧必须首先被两个电子还原到过氧化物的水平，然后O-O键断裂。这种键可以均匀地断裂，产生两个羟基自由基，也可以异质断裂，产生H2O和一个6价电子的裸O原子。在大多数情况下羟基自由基在酶活性部位的释放必须避免，大自然设计了血红素的结构，以确保异质断裂途径占主导地位。 辣根过氧化物酶（HRP)是血红素酶的主要成员，也是研究最早的酶。HRP的复合物I的活性中心过渡态可以看作具有强氧化性的类自由基状态，如果氢气主要与自由基发生反应，加入氢气后酶活性应该降低。HRP可以氧化HPF产生荧光。我们在HRP体系测定了加入氢气对HPF荧光的影响。研究发现，氢气可以提高HRP氧化HPF的能力，增强了荧光强度。这表明氢气不仅不是被高反应性的HRP酶的活性中心氧化，反而可以增强酶的氧化能力。
氢气促进HRP氧化HPF。（Li Q，2021） 为进一步确定氢气对酶活性的影响，我们用经典方法对HRP的酶活进行了测定。选用比色法以愈创木酚为底物，436nm处检测生成的四邻甲氧基连酚吸光值的变化来计算酶活，以氮气作为对照。结果表明，与增强HPF荧光类似，氢气可以提高HRP酶的活性。
氢气促进HRP酶活性。（仪杨，2020）
由于中间产物易于纯化和稳定，在反应过程中形成的中间产物可以用光谱学方法方便的追踪，HRP是研究血红素酶的理想材料。HRP在H2O2存在时能够催化多种有机和无机化合物氧化，催化过程酶和活性中心包含多种中间化合物状态的形成。首先，HRP的血红素基团经过两电子氧化而成为复合物I（HRPⅠ）。在最初的HRPⅠ形成机制中，远端组氨酸（His）将过氧化氢O1的质子（H）转运到O2的氧（O），从而促进O-O键的异构化。然而，远端His距离O1太远，无法直接形成强氢键。因此在改进的“wet”机制（Groves J T, 2014；Chreifi G，2016）中，强调水分子的媒介作用，即水分子进行干预，并通过远端His作为从O1原子到O2原子的质子转移管道，协助O1质子向O2的转移。晶体结构也显示一个有序的水分子正好在预计的位置。在“wet”机制中引入水分子，在酶的活性中心可以通过氢键使HRP的铁卟啉中心与氨基酸的残基以及过氧化氢之间顺利的进行电子的交换和能量转移，形成高催化活性的HRPI。氢分子是有可能在HRPⅠ的氢键网络形成中发挥作用的。  过氧化物酶催化活性复合物Ⅰ（HRPI）的形成机理（Poulos，2014；Groves J T, 2014）HRPI在410nm处有最大吸收峰，在底物存在的情况下，HRPⅠ会与底物发生反应迅速生成HRPⅡ，其最大吸收波长为420nm, 化合物Ⅱ可以还原回到HRP非活化的状态，当H2O2过量时，当过氧化氢过量时HRPⅡ进一步形成非活性化合物HRPⅢ，此时该酶的最大吸收波长位于418nm，HRP的状态与过氧化氢的含量有关，当HRP与H2O2的浓度比值为1:10时，HRP的主要存在状态为HRPⅠ，比值为1:2000时，HRP的存在形式主要是HRPⅢ（Rodríguez-López J N, 2001）。HRPI的催化反应的过程。（Berglund G I，2002；Groves J T, 2014；Rodríguez-López J N, 2001）为了研究氢气对HRP活性中心中间复合物形成的影响，在无底物存在的情况下选用紫外光谱连续扫描。结果表明在形成HRPI或逐渐形成HRPⅢ时，铁卟啉中心从起始的403nm处逐渐向418nm处红移，而氢气处理组在300s左右时开始出现波长回复现象；加入10mM H2O2后铁卟啉中心最大波长迅速红移到418nm处的HRP Ⅲ，在HRPⅢ这种失活的状态下氢气的介入对其状态无影响。（详见仪杨，2020）紫外光谱测定氢气对HRP活性中心复合物的影响。（仪杨，2020）另外，辣根过氧化物酶有内源性荧光，这很大程度上依赖于活性中心附近能量由色氨酸（Trp117）向血红素的传递。辣根过氧化物酶中有1个色氨酸（Trp）残基和5个酪氨酸（Tyr）残基可以产生内源性荧光，而在295nm的激发波长处，内源性荧光只来源于色氨酸（Trp）（Chattopadhyay K, 2000；Brunet J E, 1983）。 为了研究氢气对酶的活性中心附近微环境的影响，对HRP进行三维荧光扫描，并以295nm为激发波长，测定内源性色氨酸的荧光强度。三维荧光扫描结果表明HRP具有比较强的内部荧光，氢气对HRP内源性氨基酸最大激发与发射波长无显著影响。以295nm为激发波长，计算色氨酸最大发射波长处的荧光值，结果显示氢气能够显著增加HRP内源性色氨酸荧光强度。另外，Trp到血红素中心的距离由 2.85 nm 缩短至 2.69 nm。 Chattopadhyay K等（Chattopadhyay K，2000）在研究pH对HRP的影响中提出氢键网络结构与排布的变化能够引起酶分子折叠结构的变化，且Trp对微环境的变化较敏感。氢气可能在Trp周围微环境中影响了氢键网络，导致Trp到血红素中心的距离变短，向血红素中心传递能量的效率增加，从而促进酶活的升高。在HRP分子中，血红素中心远端的His42，Asn70，Arg38三个被称为“口袋中心”的氨基酸在HRP催化过程中起关键的作用，HRP在催化过程中首先形成HRPⅠ, HRPⅠ是酶催化反应的限速步骤，在H2O2存在时，Asn70与His42之间通过氢键连接，形成的“Asn-His”复合物并与H2O2之间通过氢键连接，同时伴有一个电子的转移，这样血红素、Asn、His、H2O2之间通过氢键的连接形成一种过渡态的形式，这种过渡态会在Arg38的作用下进行“O-O”键的断裂，经过这样一系列的电子转移与键的断裂，HRPⅠ即高价态铁的形态出现。HRP分子中仅有一个色氨酸（Trp117），该氨基酸残基位于远离血红素中心的远端，Trp117与His42之间相连，因此色氨酸在HRPⅠ形成过程中可能影响His42与Asn70的连接，进而影响HRPⅠ的形成。因而，氢气的介入有可能改变了酶活性中心附近微环境中氢键网络的状态，令Trp117与His42之间的连接加强，从而导致“Asn-His”之间的氢键增强，电子重新排布，从而促进色氨酸向活性中心的能量传递的效率与酶的活性。氢气也显示出对于环状大π键结构的喜好，值得关注。注：氢气对HRP活性中心影响的相关研究主要由研究生仪杨和张晓康完成。我们关于氢气和AChE的研究是第一次报道氢气和生物大分子（酶分子）之间的直接相互作用，HRP的研究进一步证实了氢气对酶活性的促进作用。酶的活性中心具有特殊的微环境和高反应活性，特别是金属酶类和氧化还原酶类的活性中心，氢分子有可能参与其中发挥作用。AChE 属于丝氨酸水解酶类，是一个大的家族。HRP 属于血红素酶类，也是代表了一类酶。这提示氢分子可能通过生物酶影响更多的生化反应。在氢气与AChE和HRP两种酶的反应中，氢气作为一种还原剂并没有被酶活性中心的强氧化性（如Fe(IV)=O）氧化，而是增强了酶活性位点的氧化能力。这是重要的，否则如果氢气可以灭活氧化酶类的氧化能力的的话，生理功能必然受到影响，氢气也不可避免会表现出副作用。另外，由于氧化酶类的活性中心的过渡态多是类自由基的状态，这也从另一个角度提示，氢气与自由基不是简单的发生反应进行清除的关系。参考文献 1. 马雪梅,张鑫,谢飞,赵鹏翔,张昭,仪杨,张晓康,马胜男,李秦剑,吕宝北,刘梦昱,YAO Mawulikplimi Adzavon,孙学军,李英贤.氢气生物学作用的生物酶基础[J].生物技术进展,2020,10(1):15-22. 2. 仪杨, 张晓康, 郭博远，等. 氢气对辣根过氧化物酶活性的影响及其作用机制的研究[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2020(7):811-819. 3. Chattopadhyay K, Mazumdar S. Structural and conformational stability of horseradish peroxidase: effect of temperature and pH[J]. Biochemistry, 2000, 39(1): 263-270. 4. Brunet J E, Gonzalez G A, Sotomayor C P. Intramolecular tryptophan heme energy transfer in horseradish peroxidase[J]. Photochemistry and photobiology, 1983, 38(2): 253-254. 5. Berglund G I, Carlsson G H, Smith A T, et al. The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution[J]. Nature, 2002, 417(6887): 463. 6. Groves J T, Boaz N C. Fishing for peroxidase protons[J]. Science, 2014, 345(6193): 142-143. 7. Chreifi G, Baxter E L, Doukov T, et al. Crystal structure of the pristine peroxidase ferryl center and its relevance to proton-coupled electron transfer[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016, 113(5): 1226-1231. 8. Rodríguez-López J N, Lowe D J, Hernández-Ruiz J, et al. Mechanism of reaction of hydrogen peroxide with horseradish peroxidase: identification of intermediates in the catalytic cycle[J]. Journal of the American Chemical Society, 2001, 123(48): 11838-11847.
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