二代测序基础知识

二代测序基础概念

（这个是与二代测序相关每个部门都要掌握的）

FQ数据格式

• 高通量测序(如Illumina HiSeqTM/MiseqTM)得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），我们称之为 Raw Data或Raw Reads，结果以 FASTQ (简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列（reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。
  FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：

@HWI-ST1276:71:C1162ACXX:1:1101:1208:2458 1:N:0:CGATGT NAAGAACACGTTCGGTCACCTCAGCACACTTGTGAATGTCATGGGATCCAT + #55???BBBBB?BA@DEEFFCFFHHFFCFFHHHHHHHFAE0ECFFD/AEHH

• 1

• 2

• 3

• 4

• 1

• 2

• 3

• 4

• 其中：
  第一行以“@”开头，随后为Illumina 测序标识别符(Sequence Identifiers)和描述文字(选择性部分)；
  第二行是碱基序列；
  第三行以“+”开头，随后为Illumina 测序标识别符(选择性部分)；
  第四行是对应碱基的测序质量，该行中每个字符对应的 ASCII 值减去 33，即为对应第二行碱基的测序质量值。

原始数据过滤

• 测序得到的原始测序序列（Sequenced Reads）或者 raw reads，里面含有带接头的、低质量的reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到clean reads，后续分析都基于 clean reads。数据处理的条件如下（非标准条件，可参考，比较松的条件,这个是诺禾的过滤条件，大家比例会有所调整，但是都是过滤的这三项）：

• 去除带接头(adapter)的reads pair；

• 当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对paired reads；

• 当单端测序read中含有的低质量（Q ≤ 5）碱基数超过该条read长度比例的 50% 时，需要去除此对paired reads。

数据质量统计概念：

• Raw Base(bp)：原始数据产量，测序序列的个数乘以测序序列的长度，以bp为单位。

• Clean Base(bp)：过滤之后的有效数据量，过滤后测序序列的个数乘以测序序列的长度，以bp为单位。

• Effective Rate(%)：过滤后获得clean data 与raw data的比值。

• Error Rate(%)：碱基错误率。

• GC Content(%)：碱基G和C的数量总和占总的碱基数量的百分比。

• adapter：接头，用于上机测序。建库时引入的接头序列与测序芯片（flow cell）上固定的接头相互识别。

• index：测序的标签，用于测定混合样本，通过每个样本添加的不同标签进行数据区分，鉴别测序样品。

• Q20,Q30：Phred 数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比，其中Phred=-10log10(e),e为错误率。

• raw data/raw reads：测序下机的原始数据。

• clean data/clean reads：对原始数据进行过滤后，剔除了低质量数据的剩余数据。后续分析均基于clean data。

参考基因组的一些概念：

• Seq number：基因组组装的序列总数。

• Total length：基因组组装结果总长度。

• GC content：碱基G和C的含量。

• Gap rate：组装结果中N所占的比例。

• N50 length：scaffold N50长度，表示组装结果中有一半的序列长度大于该值。

• N90 length：scaffold N90长度，表示组装结果中有90%的序列长度大于该值。

比对统计的一些概念：

• Mapped reads：比对到reference上的reads条数（包括单端比对和双端比对）。

• Total reads：有效测序数据的reads总条数。

• Mapping rate：比对率，比对到参考基因组上的reads数目除以有效测序数据的reads数目。

• Average depth：平均测序深度，比对到参考基因组的碱基总数除以基因组大小。

• Coverage at least 1X：参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的百分比。

• Coverage at least 4X：参考基因组至少有4个碱基覆盖的位点占基因组的百分比。

SNP概念

• SNP(单核苷酸多态性) 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换等。
  主要类型：

• Exonic：变异位于外显子区域；

• missense：非同义变异；

• Stop gain：使基因获得终止密码子的变异；

• Stop loss：使基因失去终止密码子的变异

• synonymous：同义变异。

• Intronic：变异位于内含子区域。

• Splicing：变异位于剪接位点（内含子中靠近外显子/内含子边界的2bp）。

• Downstream：基因下游1 Kb区域。

• Upstream/Downstream: 基因上游1 Kb区域，同时也在另一基因的下游1 Kb区域。

• Intergenic：变异位于基因间区。

• ts：transitions，转换。

• tv：transversions，颠换。

• ts/tv：转换与颠换的比率。

二代测序原理

测序技术发展

illumina测序原理

• 高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名二代测序|下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的桑格测序|一代测序（Sanger Sequencing）而言的。相对于Sanger测序而言，二代测序可以提供中等的读长和适中的价格，适合de novo 测序、转录组测序、宏基因组研究等。

• Solexa的测序原理是可逆终止化学反应。Solexa是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By-Synthesis，SBS)的新型测序方法。通过利用单分子阵列实现在小型芯片(Flow Cell)上进行桥式PCR反应。由于新的可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息。

• 桥氏PCR原理

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• 二代测序建库测序大致流程
  DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过illumina HiSeqTM PE150进行测序。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度>2nM），以保证文库质量。

二代测序数据拆分

• 原始下机数据睡bcl文件，根据前面建库的index信息，进行数据的拆分，除非是包lane或者包run，否则二代测序公司是不会提供该文件的

• 外包测序返回的是拆分后的rawdata及质控后的cleandata，由rawdata到cleandata的数据过滤过程称为质控

二代测序数据质控

• 质控主要进行低质量，含N，含adpter的过滤

• 过滤主要考虑的参数：

1. 数据有效数据利用率，一般要求高于95%，现在正常项目大多在99%

2. 数据量，数据量所有样品，高于约定数据量的95%，看合同签订的是raw还是clean

3. Q20一般要>90%（illunima官方承诺85%）

4. Q30一般要>85%（illunima官方承诺80%）

5. GC含量，一般波动不大，5%波动以内，群体复杂的要特殊考虑

6. GC波动情况（WGS几乎无波动，简化基因组及panel的另行考虑）

7. NT比对情况，要求无污染，现在公司不会直接提供，GC波动大时，可以要求测序公司提供，以排除污染。

• 参考资料：两份测序公司的质控报告，供参考学习（有报告是有明显异常的，需要大家找出）

• 上述质控参考指标的图表

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二代测序数据比对分析

比对分析软件及最重要的软件流程

• 重测序
  必做

bwa index # 基因组建索引
bwa mem #比对
samtools/gatk sort #排序123123

可选

samtools/gatk rmdup #去重 gatk remap # 重call

• 1

• 2

• 1

• 2

比对分析统计结果展示

• 一般要求：

• 比对率，大部分非异常样品都会在90%甚至99%以上

• 深度，达到合同或者后续分析的需求

• coverage达到一定水平（85%以上）

• 重复率低于20%，这个报告没有，但是我们可以统计，不会提供给客户，但是是内部测评的重要指标

二代测序变异检测

变异检测软件

• samtools

• GATK

• angsd

• freebase

• 前两个还是主流软件

变异检测注释软件

• annvoar（人，动物比较多）

• snpEff（植物较多使用）

过滤条件

• 个体过滤

• 根据深度情况过滤深度4或者更高的7，10

• 质量值20/30

• 群体过滤

• 根据群体情况，进行总体深度的过滤

• 质量值20/30

• 个体质量值5/10/20和个体深度4/7/10

• miss：0.1/0.2/0.5～

• maf：0.01/0.05

• 上述仅供参考，还需要根据具体情况进行参数的调整，但是一般这些项是要过滤的

结果展示