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二代建库流程详解

 刘得光3p6n6zqq 2021-06-09

越来越多的科研学者使用二代测序(Next-Generation Sequencing)进行自己课题研究,很多科研人员选择将样本直接寄送到二代测序科服公司进行实验。很多人可能并不了解文库构建的完整流程,今天小编就给大家介绍几种常见文库构建的流程。

一. DNA建库流程:

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DNA建库的完整流程:

  1. 基因组DNA片段化:由于目前测序仪读长有限,如双端各测150bp或75bp等,可采用酶打断和超声打断两种方式,酶打断操作更方便,更节省时间,但目前酶打断还有一定的偏好性,超声打断还是主流打断方式;

  2. 末端修复:打断后的DNA末端会有粘性末端,需要进一步补平成平末端;

  3. 加A:与接头T互补配对,增加接头连接效率;

  4. 加接头:接头是一段固定序列,能够与芯片配对发生成簇反应,可分为长接头(index在接头上,index区分不同文库样本),短接头(index通过PCR引入);

  5. 磁珠纯化:一般此步骤采取两步磁珠纯化,根据磁珠优先吸附大片段原理,通过使用不同体积磁珠,第一步磁珠纯化去除大片段,第二步磁珠纯化去除小片段,从而得到合适片段长度文库;

  6. PCR扩增:通过接头引物扩增富集文库;

  7. 磁珠纯化:纯化文库;

  8. 文库质检:一般先用Qubit进行文库定量,然后使用2100仪器进行文库片段分析,通过qPCR进行绝对定量,混样上机。

二、 mRNA建库流程:

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  1. mRNA分离:mRNA的3’端有Poly A结构,利用Oligo dT磁珠将mRNA从总RNA中拉出来。mRNA建库对RNA质量要求较高,一般要求RIN值大于7,RNA发生降解会引起只能捕获到mRNA 3’端信息,5’端信息会发生丢失;

  2. mRNA片段化:一般使用Mg离子及高温打断,片段化长度与打断时间相关;

  3. 一链二链合成:将mRNA先反转录成cDNA,再进行二链合成;

  4. DNA建库:后续步骤和DNA建库步骤相同,只是不要打断步骤。

三、LncRNA建库流程

LncRNA建库流程与mRNA建库整体流程类似,只是第一步mRNA纯化改为rRNA去除,目前市面rRNA去除主要有四种方法:

  1. 磁珠连接探针去除:通过碱基互补配对原理,对于rRNA序列有依耐性,不同物种使用不同探针类型;去除rRNA后后续建库流程与;
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  1. DNA探针去除法I:根据rRNA序列设计特异性DNA探针,将探针与总RNA混合后进行退火延伸,rRNA会形成DNA/RNA双连结构,利用RNAase H降解嵌合链中RNA,再用DNA酶降解DNA探针,剩下mRNA及LncRNA建库流程与mRNA建库流程一致,此法也是基于rRNA序列,不同物种使用不同探针;
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  1. DNA探针去除法II:先用随机引物进行一链合成,按建库流程构建单链文库,特异性DNA探针能与rRNA单链文库退货延伸,形成双链结构,在反向接头上带有特殊酶切位点,一旦形成双链结构,酶切位点能够被酶识别,将接头切除,rRNA不带有完整接头,mRNA及LncRNA带有完整接头,通过接头引物富集的即是mRNA及LncRNA信息,此法也基于rRNA序列,不同物种使用不同探针;
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  1. 变形退火法去除rRNA:此法是目前最新研发出来的rRNA去除方法,不过目前市场用户还不多,效果还有待进一步验证。先使用随机引物进行一链合成,然后进行变性形成单链cDNA及单链RNA混合样本,加入特殊化学成分,能识别rRNA,促进rRNA与其对应的cDNA退火,而LcnRNA及mRNA则不会与cDNA退火,加入酶mix消化双链rRNA/cDNA,后面在进行常规的建库步骤。此原理不基于RNA序列,没有物种局限性。此原理还有待市场验证,如果效果理想将是rRNA去除突破性技术,可能会取代前三类rRNA去除技术。
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