【新知解读】磁性相吸，智珠在握

磁珠是NGS实验中使用频率最高的试剂之一，不知道大家是否有过这样的疑问：SCB是啥？SPB又是啥？MP和SPB是同一种磁珠吗？大珠小珠，傻傻分不清楚。今天小石头就带领大家慧眼识“珠”~

磁珠是一类将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性的微球。

磁珠的基础结构分为三层，内核是聚苯乙烯材料；中层是磁性物质，一般为氧化铁的混合物；最外层包覆高分子外壳，既避免目标分子直接接触氧化铁，又可以为不同实验提供不同的官能团修饰。

图1. 磁珠的基础结构

应用于磁分离技术的磁性微球具备粒径均一、比表面积大、顺磁性、物理化学性质稳定等特点，它们在外加磁场的作用下表现出磁响应性，而去除磁场又具有良好的悬浮性，可以形成单分散体系，具有较大的吸附容量。因此，磁分离技术可以快速实现磁性微球的分散和分离。

在分子生物学中，利用磁珠分离DNA、RNA和蛋白质是一种简单有效的方法。磁分离技术最大的优势在于以最少的处理步骤从各种类型的样本粗提物中直接分离核酸。

  图2. John Ugelastad教授 | NTNU (CC-BY 4.0)

从1976年挪威化学教授John Ugelastad成功生产了大小均一的聚苯乙烯微球到几十年后的今天，诸如核酸提取、靶向捕获、蛋白纯化、免疫沉淀、细胞分选等常见生物实验技术均已广泛应用磁分离技术。

本期小石头带大家来关注磁珠在NGS领域的应用。

硅羟基磁珠

▍NGS应用

核酸提取是NGS检测中关键步骤之一，而硅羟基磁珠是核酸提取中使用最为广泛的磁珠，它可以将核酸从石蜡切片、血液等样本经过前处理、裂解消化后形成的粗提物中提取出来。该方法相较于离心柱提取法，消除了样本堵塞吸附膜的影响，操作简便并且有利于自动化，因而在高通量测序检测中广泛应用。

 图3. 磁珠法核酸提取流程

▍原理

使用硅羟基磁珠提取核酸时，通常需要高浓度的离液盐（GuHCl、GuSCN等）来有效屏蔽溶液中核酸分子之间的静电斥力。同时，离液盐离子竞争性地与磁珠表面以及核酸分子相结合，破坏二者表面原有的水化层，促进核酸分子通过氢键和范德华力吸附到磁珠表面。常用的离液盐如胍基离子对PCR有抑制作用，在后续的洗涤步骤中将会被漂洗去除。

羧基磁珠

▍NGS应用

羧基磁珠可以用于蛋白质、核酸等生物物质的分离纯化，同时还可以用于微生物检测、免疫检测、靶向给药等领域，在NGS检测中主要应用于文库构建中的纯化和片段筛选步骤。

▍原理

羧基磁珠纯化基于固相可逆固定化技术（solid-phase reversible immobilization，SPRI）：在一定浓度的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和盐离子的存在下，DNA分子脱去水化层，构象发生改变暴露大量携带负电荷的磷酸基团，磷酸基团通过溶液中的盐离子与磁珠表面修饰的羧基形成电桥，使得DNA被吸附到磁珠表面。这一吸附动作是可逆的，当我们改变溶液环境，如用一定浓度的乙醇洗涤PEG和盐离子之后，加入洗脱液，DNA恢复水化脱离磁珠表面。

图4. 羧基磁珠吸附核酸模式图

在纯化的基础上，羧基磁珠还可以实现目标大小片段的筛选。这是由于分子量越大的核酸分子，越倾向于在PEG存在条件下发生构象改变，因此PEG的浓度是关键因素。PEG浓度由低到高，相当于我们加入的磁珠悬液由少到多，磁珠可以吸附到的DNA片段下限越低。

链霉亲和素磁珠

▍NGS应用

链霉亲和素磁珠在NGS检测中主要应用于杂交捕获步骤。在过去的15年中，链霉亲和素偶联磁珠已被广泛使用并被引用。实例包括直接/间接分离，核酸、蛋白质/肽和其他靶分子的下游处理。在基于核酸的诊断中，特别是对于高离液盐浓度的样品，涉及小生物素化抗原的免疫测定以及与BSA不兼容的应用，特别适合于序列特异性DNA / RNA捕获。

▍原理

链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，由四条相同的肽链组成，每条肽链都可以结合一个生物素。链霉亲和素和生物素的复合物解离常数在10^-14 mol/L级别，是目前已知最强的蛋白与其他分子间非共价的生物相互作用。一般认为这一复合物不会受pH、温度、有机溶剂、变性剂等极端因素影响，但也有研究发现在非离子表面活性剂中70℃条件孵育一段时间，可以在不破坏链霉亲和素的情况下解离这一复合物。

图5. 链霉亲和素磁珠捕获模式图 | 参考资料[6]

链霉亲和素磁珠分为基于甲苯磺酰基活化的疏水性表面磁珠，和基于羧基的亲水性表面磁珠。前者常用于蛋白纯化、核酸结合等，后者用于含有高浓度离液盐的核酸实验、单链DNA的制备等等。

在NGS实验中，杂交捕获使用基于甲苯磺酰基活化的磁珠，杂交探针上标记有生物素，探针与目标DNA分子孵育杂交后，利用链霉亲和素磁珠结合生物素从而进一步分离杂交复合物。

磁珠使用的注意事项

●  磁珠使用时应避免对磁珠进行冷冻等操作，使用前需平衡至室温，否则影响实验效果（PEG分离效果易受pH、温度等影响）；

●  用于磁珠漂洗的一定浓度的乙醇需现配现用；

●  洗脱时，需待磁珠表面晾干至不反光再加入洗脱液，但不得过分晾干以至磁珠表面裂开，这会降低DNA的洗脱效率；

●  为减少磁珠损失，每次磁性分离的时间应不少于 1 min；

●  从磁珠保存管中移取磁珠前应充分震荡重悬均匀，操作过程中应避免产生气泡；

●  建议使用质量好的移液器吸头和反应管，避免因耗材吸附磁珠及溶液而造成损失。

总结回顾

读到这里，对开篇的问题相信大家心中已经有了答案。这里将不同磁珠的应用和原理汇总为一个表格，供大家学习回顾。

表1. NGS检测中使用到的不同磁珠

注：表中列出的试剂名称为燃石试剂盒中的磁珠名称。

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参考资料：

[1] Neurauter AA, et al. Cell isolation and expansion using Dynabeads®. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 2007;106: 41-73. DOI10.1007/10_2007_072.

[2] Sinclair B. To Bead or Not to Bead: Applications of magnetic bead technology. Available online: http://www./?articles.view/articleNo/18984/title/To-Bead-or-Not-To-Bead–Applications-ofMagnetic-Bead-Technology/(accessedon 21 November 2015).

[3] Clarke AC, et al. DNA sizeselection using AMPure XP‐derived PEG–Bead solution. BMC Genomics 2014,15:68. http://www./1471‐2164/15/68.

[4] Holmberg A, et al. The biotin-streptavidin interaction can be reversibly broken using water atelevated temperatures. Electrophoresis 2005, 26, 501–510. DOI10.1002/elps.200410070.

[5] The attraction is simply magnetisk Dynabeads® Streptavidin products and applications. https://www./cn/zh/home/brands/product-brand/dynal/ streptavidin-coupled-dynabeads.html

[6] Li CL, et al. Androgen Receptor Enhances Hepatic Telomerase Reverse Transcriptase Gene Transcription After Hepatitis B Virus Integration or Point Mutation in Promoter Region. Hepatology 2019, 69: 498-512. DOI10.1002/hep.30201.

[7] 李金明. 高通量测序技术. 科学出版社, 2018.

关于燃石医学

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