【原】发现：肾结石基质中存在五种新型蛋白质

人肾草酸钙结石基质：参与尿石症复杂机制的新型蛋白质的表征

Priya A K , Simran T , Kumar N P , et al. Peeping into Human Renal Calcium Oxalate Stone Matrix: Characterization of Novel Proteins Involved in the Intricate Mechanism of Urolithiasis[J]. Plos One, 2013, 8(7):e69916.

背景：越来越多的尿石症患者代表了当今全球肾病学家面临的主要挑战之一。为了提高这种疾病的治疗效果，需了解肾结石形成的致病基础。人肾结石基质中的主要成分是蛋白质，被认为在晶膜相互作用、晶体生长和结石形成中具有潜在作用，但它们在尿石症中的作用仍不清楚。

方法：从含有肾结石的人 CaOx 基质中分离蛋白质。对MW>3kDa的蛋白质进行阴离子交换层析，然后进行分子筛层析。测试了这些纯化蛋白质对 CaOx 成核和生长以及对草酸盐损伤的 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 肾上皮细胞的活性的影响。蛋白质通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI-TOF MS) 进行鉴定，然后使用 MASCOT 服务器进行数据库搜索。还研究了与 CaOx 晶体的硅分子相互作用研究。

结果：通过 MALDI-TOF MS 从草酸钙肾结石基质中鉴定出五种蛋白质，然后使用具有控制结石形成过程能力的 MASCOT 服务器进行数据库搜索。其中两种蛋白为启动子，两种蛋白为抑制剂，一种蛋白对CaOx成核和生长具有抑制和促进双重活性。进一步的分子建模计算揭示了这些蛋白质与 CaOx 在分子水平上的相互作用模式。

结论：我们鉴定并表征了乙醇胺磷酸胞苷转移酶、Ras GTPase 激活样蛋白、UDP-葡萄糖：糖蛋白葡萄糖基转移酶 2、RIMS 结合蛋白 3A、巨噬细胞加帽蛋白作为来自人草酸钙结石基质的新型蛋白质在肾结石形成中起关键作用。因此，这些具有调节草酸钙结晶潜力的蛋白质将为理解和控制人类尿石症提供线索。

前言

     人肾结石由结晶相和非结晶相组成；80% 的结石由草酸钙 (CaOx) 和支撑结构组成，即有机基质占结石总重量的 2-5% [1], [2] 并分布在所有结石的结构中 [3] .蛋白质是构成基质的主要部分，有机基质被认为在结石形成和生长中很重要 [4]。建议大分子通过在表面诱导晶体成核并作为粘合剂或桥梁将晶体结合在一起形成大聚集体并为更多溶质沉积提供平台来指导结晶过程，从而导致晶体生长[5]。

     在生理条件下，CaOx 的尿过饱和度永远不会高到导致均匀成核；促进剂可能有助于这种盐的沉淀[6]。尿石症的纯促进剂很少见，但某些物质可以在晶体形成的特定阶段充当促进剂，并在其他阶段充当抑制剂，例如糖胺聚糖促进晶体成核但抑制晶体聚集和生长。Tamm-Horsfall 糖蛋白 (THP)，根据其聚集阶段，可能作为晶体形成的促进剂或抑制剂 [7]。到目前为止，已经在人体结石有机基质中检测到了几种蛋白质 [8]、[9]，但它们与结石形成的关系尚不清楚。结石研究已经在分子水平上实现了当前关于结石发病机制的想法，但结石形成背后的机制仍然不清楚。高草酸尿症被认为是结石形成的诱发因素 [10]。研究发现，三分之二的草酸盐在病理状态下会积聚在肾细胞的细胞质中，表明草酸盐可能在分子水平的紊乱中起关键作用[11]。草酸盐介导的基因表达也已被充分证明，并且在高草酸血症期间会促进成石蛋白的生成 [12]、晶体结合分子（如骨桥蛋白）的过度表达 [13]、[14]。可以与草酸盐结合的蛋白质将是这种病理表达的介质。因此，鉴定此类蛋白质可以揭示结石的发病机制。目前的研究旨在从人肾结石基质中分离蛋白质，并评估它们对 CaOx 形成不同阶段的影响。在此，我们提供了证据，证明人类肾结石基质中存在五种新型蛋白质，这些蛋白质在影响结石形成方面起着关键作用。 

材料和方法

肾结石系列

    本研究获得印度昌迪加尔医学教育与研究研究生院 (PGIMER) 机构伦理委员会的批准（日期：25/11/2011；编号：PGI/IEC/2011/560-561）。参与者提供了他们参与本研究的口头知情同意书。对同意使用手术切除的结石的患者进行了记录。医学教育与研究研究生院伦理委员会批准了这一同意程序。结石为非感染性结石，采集自 25 岁以上且无其他异常的患者。经过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析，选择以钙和草酸盐为主要成分的结石用于本研究。来自每个患者的结石没有单独处理，而是从不同患者收集并汇集在一起进行这项研究。50 颗以钙和草酸盐为主要成分的结石用于进一步研究。50 个结石样本随机分为 5 组，每组包含 10 个结石样本。

1.从人肾结石中提取蛋白质

使用EGTA作为脱矿剂从含有CaOx作为主要成分的肾结石基质中分离蛋白质。石头在 0.15 M NaCl 中轻轻搅拌 48 小时以去除粘附的血液、组织等。然后将它们干燥并用研钵和研杵粉碎。然后通过将每克石头悬浮在 10 mL 0.05 M EGTA、1 mM PMSF 和 1% β-巯基乙醇中来提取粉状石头有机基质。在 4°C 下持续搅拌萃取 4 天。悬浮液在 4°C 下以 10,000 x g 离心 30 分钟。EGTA提取物的上清液通过Amicon超离心过滤装置过滤，在4°C下截留分子量为3kDa并浓缩。完整的 EGTA 提取物和大于 3 kDa 的馏分储存在 -20°C 以供进一步研究 [15]。

2.蛋白质测定

以 BSA 为标准，通过 Lowry 方法测定总蛋白质浓度 [16]。

（1）测定蛋白质 w.r.t CaOx 晶体成核的抑制活性

使用的方法类似于 Hennequin 等人描述的方法。有一些小的修改[17]。在含有 Tris 0.05 mol L-1 和 NaCl 0.15 mol 的缓冲液中制备氯化钙 (CaCl2) 和草酸钠 (Na2C2O4) 溶液，最终浓度分别为 3 m mol L-1 和 0.5 m mol L-1 L-1，pH 6.5。两种溶液均通过 0.22 µm 过滤器过滤；将 1.5 mL CaCl2 溶液与不同浓度的提取蛋白混合。通过添加 1.5 mL Na2C2O4 溶液开始结晶。最终溶液在 37°C 下以 60 秒的间隔重复搅拌 8 分钟。每 60 秒后在 620 nm 处监测溶液的吸光度。蛋白质提取物产生的抑制百分比计算为 [1-(Tsi/Tsc)] X 100，其中 Tsc 是对照的浊度斜率，Tsi 是抑制剂存在下的浊度斜率。

（2）测定蛋白质活性的测定 w.r.t. CaOx 晶体生长

使用晶种、溶液消耗测定法测量对 CaOx 晶体生长的活性 [18]。简而言之，将 1.5 mg/ml CaOx 晶体（来自 FTIR 鉴定的临床肾结石）浆液添加到含有 1 mM CaCl 2 和 1 mM Na 2 C 2 O 4 的溶液中。CaCl2 和 Na2C2O4 之间的反应会导致 CaOx 沉积在晶体表面，导致游离草酸盐的消耗，可通过分光光度计在 λ214 nm 处检测到。当将蛋白质加入该溶液中时，如果蛋白质抑制 CaOx 晶体生长，游离草酸盐的消耗速率将降低。使用基线值和有或没有蛋白质孵育后的值计算游离草酸盐的减少率。相对抑制活性计算如下：%相对抑制活性 = [(C–S)/C]×100，其中C是没有任何测试蛋白质的游离草酸盐的减少率，S是游离草酸盐的减少率与测试蛋白质。

 3.SDS-PAGE 分析

    MINI-PROTEAN 3 细胞（Bio-Rad Laboratories）用于 SDS-PAGE 分析。冻干样品在还原样品缓冲液中重构，并使用 1 mm 厚、10% 分离凝胶和 4.4% 浓缩凝胶通过一维不连续 SDS-PAGE 进行分析。使用 ProteoSilver™ Plus Silver Stain Kit (PROTSIL2, Sigma-Aldrich Co.) 对蛋白质条带进行银染色。宽范围和低范围分子量标记物（目录#161-0317、#161-0304 Bio-Rad）用作标准[19]。

4.原生-PAGE 

    进行分子筛色谱后获得的级分的电泳，保持蛋白质生物分子的天然构型。本机页面的凝胶以10%的浓度使用，不使用SDS或2-巯基乙醇（还原剂）。用于天然凝胶的电泳缓冲液的摩尔浓度为 50 mM Tris-Cl 和 284 mM 甘氨酸。将凝胶过度运行 15 分钟并使用银染进行染色。

5.细胞培养

   Madin-Darby 犬肾 (MDCK) 细胞获自国家细胞科学中心 (NCCS, Pune)。细胞在调整为含有 3.7 g/L 碳酸氢钠、4.5 g/L 葡萄糖和 2.0 mM L-谷氨酰胺的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中保持为单层。培养基中添加了 1% 青霉素 (100 单位/mL)-链霉素 (10,000 µg/mL) 和 10% 胎牛血清。细胞在 25 cm2 组织培养处理过的烧瓶中在 37°C 和 5% CO2 的加湿室中培养 [20]。

6.草酸盐诱导的细胞损伤

MDCK 细胞在含有 1 mM 草酸钠的 DMEM 中在不同浓度的蛋白质样品存在下孵育 72 小时 [21]、[22]。通过使用四唑 (MTT) 比色法、硫罗丹明 B (SRB) 蛋白染色法和吖啶橙/溴化乙锭 (AO/EB) 染色检测细胞凋亡来测量细胞活力来评估细胞损伤。

7.蛋白质样品的制备

   对于细胞培养研究，蛋白质通过 Millipore Amicon Ultra Centrifugal Filters (3 kDa) 透析并通过 Bio-Rad ReadyPrep 2-D Cleanup Kit 脱盐，并在使用 Millipore Millex GV Filter Unit 0.22 µm 过滤的蒸馏水中重构。这被视为蛋白质的储备溶液。

8.细胞培养研究：MTT 分析

   将 MDCK 细胞接种到两个 96 孔板中（1×104 个细胞/孔）。在接种和 24 小时恢复后，细胞在 37°C 下在含有 5% CO2 的加湿培养箱中恢复指数生长，对细胞进行各种处理。对照组的细胞仅在 100 μl DMEM 培养基（不含 FBS）中培养。对于草酸盐损伤，细胞用 DMEM 中的 1 mM 草酸盐处理。通过在草酸盐存在下向细胞中添加不同浓度（1、2、4 µg/ml）的纯化蛋白质，评估了存在草酸盐损伤时蛋白质的作用。为了验证纯化的蛋白质本身是否有助于细胞毒性，还在没有草酸盐的情况下将细胞与不同浓度（1、2、4 µg/ml）的蛋白质一起孵育。处理72小时后，每孔加入30μl MTT（终浓度0.5mg/ml）。三小时后，弃去上清液，加入酸性异丙醇溶解甲臜结晶。吸光度值在 570 nm 测试波长和 630 nm 参考波长下测定，以使用酶标仪 (Bio-Rad) 测试细胞活力。[23]。

9.细胞培养研究：SRB 检测

    硫罗丹明 (SRB) 测定如先前在文献中所述进行 [24]。播种和处理方案与MTT测定相同。处理72小时后，用40%冰冷的三氯乙酸（50μl/孔，终浓度1%）在4°C下通过蛋白质沉淀固定细胞1小时。固定后，用蒸馏水洗涤细胞 5 次，染色 30 min。在室温下，将 0.4% SRB 溶于 1% 乙酸（100 µl/孔）中。未结合的 SRB 染料通过用 1% 乙酸洗涤板 5 次而去除。将板风干并用 200 µl/孔的 10 mM 无缓冲 Tris 碱 (pH 10.5) 溶解结合的蛋白质染色剂。使用 Bio-Rad 3350 酶标仪在 490 nm 处读取光密度。

10.吖啶橙/溴化乙锭染色检测细胞凋亡

    将 0.5 × 10 5 个细胞/孔的 MDCK 接种在 24 孔板中，并在含有 5% CO2 的加湿培养箱中培养 24 小时。空白对照组细胞仅在DMEM培养基（不含FBS）中培养。对于草酸盐损伤，细胞用 DMEM 中的 1 mM 草酸盐处理。在草酸盐存在下，用浓度为 4 µg/ml 的纯化蛋白质处理细胞。还测试了仅纯化蛋白质的作用以检查其对细胞的细胞毒性作用。处理 72 小时后，将每个孔中的细胞悬液与胰蛋白酶消化后的细胞一起汇集到 eppendorf 小瓶中。将小瓶以 129 g 离心 5 分钟。获得的沉淀用 1X PBS 洗涤，并用 25 µL PBS 和 2 µL EB/AO 染料 (100 µg/ml) 的吖啶橙/溴化乙锭溶液染色。将细胞置于覆盖有盖玻片的载玻片上，并在荧光显微镜 (Nikon EclipseTi) 下以 200X 的放大率观察。拍摄照片时考虑了以下参数：吖啶橙使用的激发波长和发射波长为 440 nm 至 480 nm 和 520 nm 至 560 nm，而溴化乙锭的激发波长和发射波长为 445 nm 和 605 nm [25 ]。

11.蛋白质的纯化和表征

    超过 3 kDa 的 EGTA 级分对 CaOx 晶体成核和生长分析系统表现出显着的活性，因此它经受强阴离子交换剂 Macro Prep® High 25 Q (Bio-Rad)。柱子 (50×1cm) 预先洗涤并用含有 0.1 mM NaCl (pH 7.4) 的 20 mM Tris 缓冲液平衡。通过在柱缓冲液中加入线性浓度梯度的 NaCl (0.1–1 M)，同时保持 pH 值恒定，流速为 0.5 mL/min，从而洗脱结合的蛋白质。监测所有级分的蛋白质含量 (A280) 并同时测量它们的电导率。汇集低于峰值的级分，透析并研究它们的生物活性。将获得的所有级分浓缩并逐一加载到 Biogel® P-100 凝胶分子筛柱（50×1 cm）上，用 20 m mol L-1 Tris 缓冲液（pH7.4）以流速平衡和洗脱0.1 毫升/分钟的速度 [26]。将基于其分子量洗脱的级分合并以研究它们的活性 w.r.t. CaOx 晶体成核和生长以及草酸盐对 MDCK 细胞的损伤。

12.RP-HPLC 均一性

Waters Spherisorb® C18 (5 μ, 4.6 X 250 mm) 色谱柱和溶剂 A（0.1% TFA 水溶液）和溶剂 B（100% 乙腈，含 0.1% TFA）用于确定纯化蛋白质的均质性。在蛋白质注射时流速保持在 1 mL/min。用溶剂 A 洗涤柱子并在 5 分钟内加入 20% 乙腈。在 50 分钟内用线性梯度的乙腈 (20–70%) 洗脱结合的蛋白质。使用 Waters 2996 光电二极管阵列检测器在 280 nm 处监测检测 [27]。

13.纯化蛋白质的胰蛋白酶凝胶内消化

从凝胶上切下分子筛色谱后检测到的单条带，并用 ProteoSilver™ Plus Silver Stain Kit (PROTSIL2, Sigma-Aldrich Co.) 中提供的脱色剂脱色。胰蛋白酶谱 IGD 试剂盒（PPO100，Sigma-Aldrich Co.）用于纯化蛋白质的凝胶内消化。将脱色的凝胶片干燥约 15 至 30 分钟。将胰蛋白酶溶解在 1 m mol L-1 HCl 中并与 40 m mol L-1 碳酸氢铵和 9% 乙腈混合后加入脱色凝胶片中。添加 40 m mol L-1 碳酸氢铵和 9% 乙腈 (pH 8.2) 溶液将凝胶片完全覆盖，并在 37°C 下孵育 5 小时。孵育后，从凝胶块中取出液体并转移到新鲜的 Eppendorf 管中并保存用于质谱分析。

14.MALDI-TOF-MS 和序列分析的肽质量指纹图谱

将每个蛋白水解样品与基质溶液（α-氰基-4-羟基肉桂酸）按 1∶2 的比例预先混合并点样在样品台上。在室温下干燥，然后用 0.1% TFA 洗涤，并通过 Ultraflex TOF/TOF 质谱仪（Bruker Daltonics，Remen，Germany）进行分析。质谱仪通过肽校准标准 II (Bruker) 进行校准。获得的质谱分辨率约为 6000 (FWHM)，足以识别消化的肽。使用所有 3 个数据库（MSDB、SwissProt、NCBInr）在 MASCOT 搜索引擎（http://www.）中搜索获得的质量/电荷谱。对于搜索，假设肽是单同位素的，在甲硫氨酸残基处被氧化，在半胱氨酸残基处被氨基甲酰氨基甲基化。使用了智人分类学限制，只允许一次漏切，1.2 kDa 的肽质量耐受性用于肽质量指纹图谱。

15.同源建模和结构验证

使用分子操作环境 (MOE) [28]、[29] 构建已鉴定蛋白质的同源模型：乙醇胺-磷酸胞苷酰转移酶和巨噬细胞加帽蛋白。用于乙醇胺-磷酸胞苷转移酶模型构建的模板是人类CTP的晶体结构：磷酸乙醇胺胞苷转移酶与CMP复合[PDB ID：3ELB_A]，查询覆盖率为85%，序列同一性为98%。类似地，在 Ca2+ 游离形式 [PDB ID: 1J72_A] 中具有肌动蛋白切断活性的突变巨噬细胞封端蛋白 (Cap G) 的晶体结构被用作构建巨噬细胞封端蛋白模型的模板，查询覆盖率为 100% 和95%的序列同一性。使用 OPLS 2005 力场和 Polak-Ribiere 共轭梯度 (PRCG) 算法将获得的结构能量最小化。最小化在 5,000 步后或在能量梯度收敛到 0.001 kcal/mol 以下后停止。使用 GROMACS 4.5.4 软件和 GROMOS96 力场对显式水中蛋白质结构的所有原子分子动力学 (MD) 模拟进行了 10 ns [30] 的时间尺度。施加了三维周期性边界条件，将分子封闭在用 GROMACS 包中提供的 SPC216 水模型溶剂化的十二面体中，并使用 1000 步最速下降使能量最小化。LINCS [31] 算法用于约束所有键长和截止距离，以计算 1.0 nm 处的库仑和范德华相互作用。该系统通过 100 ps 的 MD 运行平衡，对蛋白质进行位置限制，以允许溶剂分子在 300 K 和正常压力下松弛。使用 PROCHECK [32]、ERRAT [33] 和 VERIFY3D [34] 测试模型的整体质量、立体化学值和非键相互作用。

然而，没有找到适合蛋白质的模板：Ras GTPase 激活样蛋白、UDP-葡萄糖：糖蛋白葡萄糖基转移酶 2 和 RIMS 结合蛋白 3A 来构建它们的结构。

16.草酸钙对接分子

草酸钙结构是在加拿大蒙特利尔化学计算集团公司开发的分子操作环境 (MOE) 包的分子构建器的帮助下构建和几何优化的。使用MOE软件的活性位点查找工具预测蛋白质的结合位点。草酸钙的分子对接是使用 MOE-Dock 完成的。MOE-dock 在对接计算中利用蒙特卡罗模拟退火 (SA) 方法在预设框中搜索小型柔性配体和刚性大分子的有利结合构型。对接能量计算是在用户指定的三维对接箱（3D对接箱）内使用模拟退火方法和OPLS-AA力场进行的。用于对接的能量网格是由 MOE-Dock 程序生成的基于网格的势场。对接能量计算为静电能、范德华力和柔韧性能的总和。范德华参数取自力场。静电场是基于力场以库仑方式计算的，使用常数介电常数 1.0 进行溶剂化。MOE-Dock 进行了 25 次独立对接运行，每个结合位点的最低对接能量构象被选择用于 LIGPLOT 分析 [35]。

草酸钙与纯化蛋白质的分子相互作用

为了研究草酸钙与蛋白质乙醇胺磷酸胞苷酰转移酶和巨噬细胞加帽蛋白之间的精确相互作用，我们对结合位点的氨基酸进行了突变。准确地说，所有酸性和碱性氨基酸都突变为丙氨酸，活性位点中的酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸等氨基酸被磷酸化。掺入这些突变后，使用 MOE-Dock 将草酸钙对接到结合位点，其参数与用于野生型的参数相似。

结果

可能影响 CaOx 晶体成核和生长的蛋白质的生物活性引导纯化分析了大于和小于 3kda 的整个 EGTA 提取物以测量对 CaOx 晶体成核和生长的活性。与小于 3kDa 的部分相比，整个 EGTA 提取物以及大于 3kDa 的部分表现出显着的抑制活性。大于 3kDa 的部分对一水草酸钙成核和生长测定系统表现出显着的活性，因此被选择用于纯化目的。超过 3kDa 的馏分被加载到强阴离子交换剂 Macro Prep® 25 Q 柱上。收集梯度增加的连续馏分，合并并命名为 P3 至 P5（图 1）。发现 P3 到 P5 的三个部分表现出对 CaOx 晶体成核的抑制活性，而 P3 表现出抑制活性，而 P4、P5 表现出对 CaOx 晶体生长的促进剂活性（图 2）。P3、P4、P5 的进一步 SDS-PAGE 分析显示存在少量条带。组分 P3、P4、P5 在 Biogel® P-100 凝胶分子筛柱（50 X 1cm）上通过分子筛色谱法（图 3, ,4,4, ,5)5）进一步纯化。蛋白质在 pH 7.4 时用 20 mM Tris 缓冲液洗脱。将通过分子筛色谱法纯化级分 P3 后收集的级分合并为 MP1 至 MP5。通过分子筛色谱纯化 P4 后收集的级分合并为 NP1 和 NP2，通过分子筛色谱纯化 P5 并合并为 OP1。代表了对 CaOx 晶体成核和生长表现出最高活性的部分 (图 6)。通过10% SDS-PAGE进一步分析这些级分。

新型蛋白质的质谱鉴定

在组分 MP1、MP2、NP1、NP2 和 OP1 中检测到的蛋白质条带被切除，凝胶内胰蛋白酶消化并通过基质辅助激光解吸/电离 - 飞行时间 (MALDI-TOF) MS 进行鉴定。使用 RP-HPLC 测试样品的纯度（图 8, ,9).9）。使用 Mascot 搜索引擎 (http://www.)，从级分 MP1、MP2、NP1、NP2、OP1 获得的 MALDI-TOF 数据与乙醇胺-磷酸胞苷酰转移酶、Ras GTPase 激活样蛋白显着匹配， UDP-葡萄糖：糖蛋白葡萄糖基转移酶 2、巨噬细胞加帽蛋白和 RIMS 结合蛋白 3A（表 1）。MASCOT 搜索引擎显示这些蛋白质的 MOWSE 评分分别为 26、31、23、26 和 23，并且具有良好的序列覆盖率。

通过纯化蛋白 (MTT ASSAY) 减少草酸盐诱导的肾小管上皮细胞损伤

评估纯化蛋白质对草酸盐损伤的肾小管上皮细胞 MDCK 的作用（图 10）。在草酸盐存在下将细胞暴露于不同浓度的纯化蛋白质中 72 小时。用培养基处理的细胞仅作为未处理的对照组。细胞活力表示为相对于未处理对照细胞的百分比。在暴露于草酸盐时受损的细胞中，细胞活力从未处理细胞（对照）的 100% 显着降低至 55.95%。单独用蛋白质处理细胞不会导致细胞活力的任何改变。控制。在草酸盐存在下暴露于不同浓度的纯化蛋白 OP1 和 NP1 导致细胞活力以剂量依赖性方式显着增加。而纯化的蛋白 MP1、MP2、NP2 以剂量依赖性方式导致细胞活力降低，从而揭示这些蛋白增强了草酸盐对细胞造成的损伤。

用 SRB 测定观察到类似的细胞活力模式（图 11），这证实了不同纯化蛋白质对草酸盐损伤肾细胞的活性。在 SRB 测定中，细胞活力表示为相对于未处理对照细胞的百分比。在暴露于草酸盐而受损的细胞中，细胞活力百分比从未经处理的细胞（对照）中的 100% 显着降低至暴露于草酸盐时的 61.23%。单独用蛋白质处理细胞不会导致细胞活力的任何改变。控制。在以浓度依赖性方式暴露于不同浓度的纯化蛋白质（OP1和NP1）以及草酸盐的细胞中，细胞活力显着增加，揭示了蛋白质对受损草酸盐细胞的保护性质。MP1、MP2、NP2 的结果重申了在之前的生存力测定中看到的发现，即各种蛋白质在肾细胞损伤的情况下表现不同。

吖啶橙/溴化乙锭染色检测细胞凋亡

使用两种荧光染料（吖啶橙和溴化乙锭）组合的差异染色模式用于对细胞中发生细胞毒性的方式进行分类（图 12，13）。13。吖啶橙 (AO) 进入所有细胞并导致细胞核呈绿色外观。当细胞质完整性受损时，溴化乙锭 (EB) 会渗透细胞并将细胞核染成红色。这导致了一种易于区分的模式，其中活细胞具有正常的绿色细胞核；凋亡细胞的范围从亮绿色到橙色的细胞核，染色质凝聚和破碎；坏死细胞显示结构正常的橙色细胞核。

我们观察到对照中没有细胞凋亡和坏死，即所有细胞都是活的。单独用蛋白质处理细胞不会导致细胞活力的任何改变。控制。当细胞被草酸盐损伤时，观察到大量细胞死亡，即细胞凋亡和坏死。然而，在草酸盐存在的情况下，用纯化的蛋白质（OP1 和 NP1）处理的细胞显示出细胞凋亡和坏死水平降低。草酸盐损伤细胞。而当细胞用 MP1、MP2、NP2 处理时，细胞凋亡和坏死的程度增加 w.r.t.草酸盐损伤细胞。单独纯化的蛋白质不会导致细胞死亡。

乙醇胺磷酸胞苷酰转移酶和巨噬细胞加帽蛋白的同源性建模及与草酸钙的分子对接

鉴定的蛋白质的晶体结构：乙醇胺-磷酸胞苷酰转移酶（图 14）和巨噬细胞加帽蛋白（图 15）在蛋白质数据库中不可用，这需要开发蛋白质模型。发现乙醇胺-磷酸胞苷酰转移酶的模型结构与模板结构之间的 RMSD 为 0.912 Å。模型的整体立体化学质量由 PROCHECK 评估。Ramachandran 图显示在大多数允许区域中有 80.8% 的残基，在其他允许区域中有 16.8% 的残基。在禁止区域没有残留，在慷慨允许区域有 2.4% 的残留。这些结果表明，大多数氨基酸处于 phi-psi 分布，与右手α-螺旋一致，并且模型可靠且质量良好。ProCheck评估的整体主链和侧链参数都非常有利。Ramachandran 图特征证实了预测模型的质量。使用 VERIFY3D 进行评估，它根据每个残留物的局部环境得出“3D-1D”轮廓，由埋藏残留物区域的统计偏好描述，极地覆盖的侧链区域的比例原子（氧和氮）和局部二级结构，也证实了三维结构的可靠性 92.51% 的残基的平均 3D-1D 得分 >0.2。

已鉴定的巨噬细胞加帽蛋白的晶体结构基于智人的 Ca2+ 游离形式（PDB ID：1J72_A）中具有肌动蛋白切断活性的突变巨噬细胞加帽蛋白（Cap G）的晶体结构建模，用作模板（图 15.A）。发现巨噬细胞加帽蛋白的模型结构与模板结构之间的 RMSD 为 1.023 Å。模型的整体立体化学质量由 PROCHECK 评估。Ramachandran 图显示 82.5%，在大多数允许区域中的残留和 15.8%，在额外的允许区域中。在禁止区域只有 0.3% 的残留物，在慷慨允许的区域有 1.4% 的残留物。这些结果表明，大多数氨基酸处于 phi-psi 分布，与右手α-螺旋一致，并且模型可靠且质量良好。ProCheck评估的整体主链和侧链参数都非常有利。Ramachandran 图特征证实了预测模型的质量。使用 VERIFY3D 进行评估，它根据每个残留物的局部环境得出“3D-1D”轮廓，由埋藏残留物区域的统计偏好描述，极地覆盖的侧链区域的比例原子（氧和氮）和局部二级结构，也证实了三维结构的可靠性 77.29% 的残基的平均 3D-1D 得分 >0.2。

通过 MOE Site finder 预测蛋白质的不同结合位点并用于分子对接。使用 MOE 的蒙特卡罗对接程序将 CaOx 对接在结合位点上。确定了配体的最佳对接姿势并使能量最小化，同时允许完整的侧链灵活性。草酸钙与野生型乙醇胺-磷酸胞苷酰转移酶和巨噬细胞加帽蛋白的结合位点的对接分别给出了 -8.9374 和 -8.8703 kcal/mol 的最佳对接评分（表 2）。在乙醇胺-磷酸胞苷酰转移酶中，酸性和碱性氨基酸似乎都参与与 CaOx 的结合。这从结合位点中酸性和碱性氨基酸的定点突变揭示。酸性氨基酸突变为丙氨酸导致对接评分从-8.937kcal/mol 降低到-7.437kcal/mol。类似地，将碱性氨基酸突变为丙氨酸导致对接评分从 -8.9374 降低到 -8.3003 kcal/mol。在氨基酸磷酸化后，对接分数从 -8.9374 kcal/mol 降低到 -8.5647 kcal/mol 的值，表明这些氨基酸的参与。生成 Ligplots 以显示已识别蛋白质和 CaOx（配体）之间的相互作用。乙醇胺-磷酸胞苷酰转移酶野生型的 LIGPLOT 显示位置 115 处的天冬氨酸 (Asp) 和酪氨酸 (tyr 135) 与草酸钙的参与（图 14C）。而当酸性氨基酸发生突变时，乙醇胺-磷酸胞苷酰转移酶的 ligplot 显示谷氨酰胺 (Gln 41) 与 CaOx 的钙有关（图 14D）。当碱性氨基酸与丙氨酸突变时，发现氨基酸天冬氨酸 (Asp) 115、谷氨酰胺 (Gln) 113、组氨酸 (His) 112、天冬氨酸 (Asp) 28 与草酸钙的草酸盐相互作用（图 14E）。发现氨基酸天冬氨酸 (Asp) 115 与钙相互作用，而甘氨酸 (Gly) 113 在磷酸化时与草酸钙的草酸盐相互作用（图 14F）。

在巨噬细胞加帽蛋白中，酸性和碱性氨基酸似乎都参与了与 CaOx 的结合。这从结合位点中酸性和碱性氨基酸的定点突变揭示。酸性氨基酸突变为丙氨酸导致对接评分从 -8.8703 kcal/mol 降低到 -6.8467 kcal/mol。类似地，将碱性氨基酸突变为丙氨酸导致对接评分从 -8.8703 kcal/mol 降低到 -7.1479 kcal/mol。在氨基酸磷酸化后，对接评分从 -8.8703 kcal/mol 增加到 -8.9757 kcal/mol 的值，表明这些氨基酸的参与。巨噬细胞加帽蛋白野生型的 LIGPLOT 未显示任何氨基酸与草酸钙有关（图 15C）。而具有突变酸性氨基酸的巨噬细胞加帽蛋白的 ligplot 显示谷氨酰胺 (Glu) 219 与草酸钙钙有关（图 15D）。当碱性氨基酸与丙氨酸突变时，发现氨基酸天冬氨酸 (Asp) 218 与钙和赖氨酸 (Lys) 253 与草酸钙的草酸盐相互作用（图 15E）。氨基酸天冬酰胺 (Asn) 234、谷氨酰胺 (Glu) 236、谷氨酰胺 (Glu) 237 与磷酸化后的草酸钙钙（图 15F）。

钙和酸性氨基酸之间的相互作用当然是合理的，但同样可以想象的是，通常在尿液 pH 值下质子化并带正电荷的碱性残基可能会被带负电荷的草酸盐基团吸引。抑制性蛋白质中碱性氨基酸的存在支持了这一点。在这两种情况下，来自分子 3D 构象的空间约束可能会限制这些简单相互作用的数量。然而，没有找到适合蛋白质的模板：Ras GTPase 激活样蛋白、UDP-葡萄糖：糖蛋白葡萄糖基转移酶 2 和 RIMS 结合蛋白 3A 来构建它们的结构。

讨论

几十年来，一直有人认为肾结石有机基质中的蛋白质在肾结石疾病中起重要作用 [36]、[37]。蛋白质的鉴定在过去受到蛋白质鉴定方法的限制，从而使得在不知道新蛋白质参与该过程的先验知识的情况下鉴定新蛋白质变得相当困难。因此，这些技术的最新进展对于研究蛋白质所起的作用是必不可少的，以便更好地了解肾结石病的病理生理学和发病机制。有机基质中存在的许多蛋白质在肾结石的形成中起着重要作用，但只有少数被鉴定和充分表征 [27]。本研究的目的是利用生物活性引导的蛋白质纯化方法和质谱蛋白质鉴定的最新进展来表征和鉴定人肾结石有机基质中具有控制结石形成机制能力的新型蛋白质。结石含有少量嵌入的蛋白质，这些蛋白质被认为在结石聚集体中起粘合作用，并且经常发现它们附着在肾乳头的尖端，推测是通过粘合接触。[38]。

    嵌入上皮细胞膜的阴离子分子，如磷脂，也被认为可以促进 COM 与肾小管的附着 [39]。然而，其他人认为某些尿液分子会抑制晶体聚集和细胞附着，这可能是因为吸附在 COM 晶面上 [40]-[45]。晶体和肾小管细胞之间的相互作用被认为是引发后续细胞反应的关键事件，导致肾结石形成。在 MDCK 细胞中检查的细胞反应，在 COD 晶体粘附期间揭示了几种蛋白质，如代谢酶、细胞结构蛋白、钙结合蛋白、粘附分子、参与 RNA 代谢的蛋白质和分子伴侣。[46]。

     已经鉴定出肾小管上皮细胞表面的许多晶体结合分子可以促进晶体粘附，包括 CD44 [47]、透明质酸 [47]、[48] 骨桥蛋白 (OPN)、[47] 膜联蛋白 II (AnxII) , [49] 核仁素相关蛋白 (NRP), [50] 和含唾液酸的糖蛋白。[40]，[45]。在正常情况下，结合管状细胞上 COM 晶体的位点可能只暴露在最低限度，但在细胞损伤后数量可能会增加，正如裸露的大鼠膀胱尿路上皮所证明的那样 [51]、[52]。某些蛋白质可以介导 COM 晶体与细胞的粘附，通过改变肾小管细胞表面晶体结合分子的暴露可以促进晶体保留和可能的肾结石形成 [53]，[54]。用聚阴离子预包覆 COM 晶体和用聚阳离子预包覆细胞各自抑制晶体附着到培养的肾上皮细胞 (55)，这意味着阴离子细胞表面分子在附着中起重要作用 

    第二种蛋白质是 Ras GTPase 激活样蛋白质 IQGAP2，它是人类中由 IQGAP2 基因编码的蛋白质 [62]、[63]。该蛋白质包含三个 IQ 结构域、一个钙调蛋白同源结构域、一个 Ras-GAP 结构域和一个 WW 结构域。它与细胞骨架的成分、细胞粘附分子和几种信号分子相互作用，以调节细胞形态和运动[64]。这种蛋白质还与钙调蛋白相关，钙调蛋白是一种在所有真核细胞中表达的钙结合信使蛋白。它包含四个 EF 手基序，每个基序都结合一个 Ca2+ 离子 [65]、[66]。此外，Ras GTPase 激活样蛋白 IQGAP2 可以作为组装支架，用于组织多分子复合物，该复合物将连接传入信号质膜上肌动蛋白细胞骨架的重组 [67]。这种蛋白质在胎盘、肺和肾中表达。在我们的研究中，我们发现 Ras GTPase 激活样蛋白 IQGAP2 促进了草酸钙晶体的成核和生长。此外，据观察，这种蛋白质会增强草酸盐对肾上皮细胞 (MDCK) 造成的损伤，从而导致细胞死亡。这是因为该蛋白质包含一个 IQ 结构域，该结构域与已知与 Ca2+ 离子结合的钙调蛋白相互作用，从而增加结石形成的可能性。此外，通过下调 ras 通路，这种蛋白质会导致细胞存活率降低和细胞凋亡增强，这在我们的研究中也得到了证明。

     第三种蛋白质被鉴定为 UDP-葡萄糖：糖蛋白葡萄糖基转移酶 2 (UGGT) 是一种存在于内质网 (ER) 中的酶。UGGT 识别带有 N 连接的 Man9-GlcNAc2 聚糖的不完全折叠的糖蛋白，并从 UDP-葡萄糖中转移一个葡萄糖残基以产生 Glc1-Man9-GlcNAc2 聚糖 (68)。这种单糖基化聚糖被凝集素样分子伴侣钙连接蛋白和钙网蛋白特异性识别，它们在 ER 中保留不完全折叠的糖蛋白并募集 ERp57 以加速二硫键交换以进一步折叠 [69]、[70]、[71]、[72] .在肾脏、胰腺、心脏和骨骼肌中发现了更高水平的这种酶。

据观察，尿石症也可能是由于蛋白质（如 THP）错误折叠所致 [73]。UDP-葡萄糖：糖蛋白葡萄糖基转移酶 2，将葡萄糖残基添加到这些错误折叠的蛋白质中，从而使钙连接蛋白和钙网蛋白结合这些蛋白质，从而阻止它们从内质网转运到高尔基体，并最终将这些蛋白质送去降解 [74]、[75]。因此，肾结石基质中存在的这种酶可能是一种适应性反应，从而防止进一步的损伤。事实上，我们已经看到用这种蛋白质处理的细胞可以从草酸盐诱导的损伤中解救出来。

第四种蛋白质被鉴定为属于 RIMBP 家族的 RIMS 结合蛋白 3A。RIM 结合蛋白 (RIM-BPs) 被鉴定为突触前活性区蛋白 RIMs 以及电压门控 Ca2+ 通道的结合伴侣。他们被建议在突触-囊泡融合装置和 Ca2+-通道之间形成功能联系。RIM-BP 基因家族在进化的不同阶段多样化，但保留了其独特的域结构。RIM-BP3 仅在哺乳动物中表达。所有 RIM-BP 基因都编码具有三个 SH3 结构域和两到三个纤连蛋白 III 型结构域的蛋白质。纤连蛋白 III 型结构域是一个进化保守的蛋白质结构域，广泛存在于动物蛋白中 [76]。已发现纤连蛋白 III 型结构域参与调节肿瘤纤维化中的伤口愈合，这被认为是失调的伤口愈合反应。早先被报道为尿石症结石形成抑制剂的纤维连接包含该结构域的 16 个拷贝 [76]。因此，由于具有相同的结构域，即纤连蛋白 III 型结构域，我们可以将 RIMS 结合蛋白 3A 的抑制活性与纤连蛋白联系起来。 

第五种蛋白质即人类中的巨噬细胞加帽蛋白由巨噬细胞和巨噬细胞样细胞中的 CAPG 基因编码。这种蛋白质是凝溶胶蛋白/绒毛蛋白肌动蛋白调节蛋白家族的成员 [77]。它以 Ca2+ 和磷酸肌醇调节的方式可逆地阻断 F-肌动蛋白丝的带刺末端 [78]，从而有助于控制非肌肉细胞中基于肌动蛋白的运动 [79]、[80]。巨噬细胞在吞噬作用中起作用，或吞噬然后消化细胞碎片和病原体。这些细胞在保护宿主方面发挥核心作用，也有助于炎症和退行性疾病的发病机制。据报道，附着在细胞表面的一水草酸钙 (COM) 晶体可以通过内吞作用被内化 [81], [82]。巨噬细胞和其他炎症细胞可以处理这些晶体并摧毁它们 [83]。大分子在有或没有保护不足的情况下都会粘附在管状细胞上。晶体可能会改变质膜，从而发生内吞作用；虽然细胞可以处理和破坏合理大小的晶体，但较大的晶体团块可能会导致细胞死亡 [84]。当与基底外侧膜结合或间质沉积的晶体太大时，巨噬细胞和炎症细胞的能力可能不足以应对晶体。发现这种蛋白质巨噬细胞封端蛋白具有双重活性，其中一方面该蛋白质抑制 CaOx 成核，另一方面该蛋白质促进 CaOx 生长。已经报道了这些蛋白质在结石形成的不同阶段发挥不同的作用，如 THP [7]、[85]、[86]。在我们的研究中，我们发现了一种具有双重活性的蛋白质，它被发现存在于巨噬细胞中；这在石头的形成中起着至关重要的作用。

我们将注意力集中在使用硅分子对接研究纯化的蛋白质与草酸钙的相互作用上。计算机模拟结果显示，结合位点中的酸性和碱性氨基酸对于 CaOx 与纯化蛋白质（乙醇胺-磷酸胞苷酰转移酶和巨噬细胞加帽蛋白）的分子相互作用至关重要。无论是蛋白质还是其他大分子作为生长和聚集的抑制剂或成核和聚集的促进剂，都意味着必须有某种机制来解释与矿物草酸盐表面的相互作用。确定尿液成分调节草酸钙结晶的分子机制对于理解和控制人类尿石症至关重要。尽管已经对这些抑制性分子控制肾结石形成的机制进行了一些初步的分子级研究，但以前的大多数研究都关注结晶的整体动力学，而不是仍不明确的分子机制。钙和酸性氨基酸之间的相互作用当然是合理的，但同样可以想象的是，通常在尿液 pH 值下质子化并带正电荷的碱性残基可能会被带负电荷的草酸盐基团吸引。这也得到蛋白质中碱性氨基酸的存在的支持。在任何一种情况下，来自分子 3D 构象的空间约束可能会限制这些简单相互作用的数量。

结论

   肾结石仍然是世界范围内的一个公共卫生问题，影响着 1-20% 的成年人口。在所有类型的肾结石中，草酸钙 (CaOx) 是通过化学分析发现的最常见的成分，迄今为止结石形成的致病机制仍不清楚。蛋白质是人类肾结石基质中的主要成分，被认为在晶膜相互作用、晶体生长和结石形成中具有潜在作用。因此，这些技术的最新进展对于研究肾结石形成抑制剂以更好地了解肾结石疾病的病理生理学和发病机制是必要的。早期已鉴定出很少有充分表征的肾结石形成抑制剂/促进剂。

我们通过生物活性引导鉴定了五种蛋白质，即乙醇胺磷酸胞苷转移酶、Ras GTPase 激活样蛋白、UDP-葡萄糖：糖蛋白葡萄糖基转移酶 2、RIMS 结合蛋白 3A 和巨噬细胞加帽蛋白作为来自 CaOx 结石有机基质的结石的新成分-蛋白质纯化和 MALDI-TOF-MS。CaOx 结石基质中这些蛋白质的存在表明它们在尿石症中的假定作用以及它们与结石形成过程的关系。本研究中使用的结晶测定提供了足够的证据，可以断言从 MW>3 kDa 的肾结石中分离的蛋白质有影响草酸钙结晶和聚集的趋势。因此，这些蛋白质的鉴定不仅揭示了肾结石形成的复杂机制，而且还提供了针对尿石症的潜在药物靶点。