虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr−/−小鼠非酒精性脂肪肝炎的作用及机制研究

摘  要：目的  探讨虎杖苷对高脂喂养的中年低密度脂蛋白受体基因敲除（low-density lipoprotein receptorknockout，LDLr^−/−）小鼠非酒精性脂肪肝炎的保护作用及机制。方法  12月龄雄性LDLr^−/−小鼠随机分为对照组、模型组、白藜芦醇（200 mg/kg）组和虎杖苷低、高剂量（100、200 mg/kg）组，对照组给予常规饲料喂养，其余各组给予高脂饲料喂养；同时给予虎杖苷和白藜芦醇干预12周后，检测各组小鼠血清代谢参数；采用油红O染色、苏木素-伊红（HE）染色和Masson染色考察各组小鼠肝脏组织病理变化；采用试剂盒检测各组小鼠肝脏中三酰甘油（triglycerides，TG）、总胆固醇（totalcholesterol，TC）、游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）水平及超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH）活性；采用免疫共沉淀法检测各组小鼠肝脏组织中乙酰化肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）表达情况；采用Western blotting法检测各组小鼠肝脏组织中氧化应激、纤维化及sirtuin 1（SIRT1）信号通路相关蛋白表达情况。结果 虎杖苷显著改善高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠代谢基础特征（P＜0.05），抑制肝脏脂肪变性和肝纤维化；显著降低肝脏组织中TC、TG、TNF-α、IL-6、MDA和HYP水平（P＜0.05）；显著升高SOD、GSH和CAT活性（P＜0.05）；显著降低肝脏中脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和α-平滑肌动蛋白（α-smoothmuscle actin，α-SMA）蛋白表达水平（P＜0.05），显著升高过氧化物酶体增殖激活受体α（peroxisome proliferator-activatedreceptor α，PPARα）和肉毒碱棕榈酰基转移酶1α（carnitinepalmitoyltransferase1α，CPT1α）蛋白表达水平（P＜0.05）；显著增加核因子E2相关因子（nuclearfactor E2-related factor 2，Nrf2）入核表达（P＜0.05）；显著升高SIRT1蛋白表达水平（P＜0.05），降低SIRT1靶蛋白肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）乙酰化水平（P＜0.05）；显著升高p-LKB1/LKB1和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylated AMP-activated protein kinase，p-AMPK）/AMPK蛋白表达水平（P＜0.05），显著降低p65乙酰化水平和p65入核表达（P＜0.05）。结论  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠非酒精性脂肪肝炎具有保护作用，且与SIRT1的激活有关。

1  材料

1.1  动物

       SPF级雄性LDLr^−/−小鼠40只，5周龄，购自南京大学模式动物研究所，动物许可证号SCXK（苏）2018-0008。动物于室温（25±2）℃、相对湿度50%～60%、昼夜12 h交替的环境中饲养，自由进食饮水。动物实验严格按照南通大学实验动物管理法规的规定和总则建议进行，伦理批准号20190105。

1.2  药品与试剂

       虎杖苷（批号JZ17021204）、白藜芦醇（批号JZ17110701）购自南京狄尔格生物科技有限公司，质量分数均为98%；含21%脂肪、0.21%胆固醇的高脂饲料购自常州开源饲料有限公司；三酰甘油（triglycerides，TG）检测试剂盒、总胆固醇（totalcholesterol，TC）检测试剂盒、游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）检测试剂盒、苏木素-伊红（HE）染液、丙二醛（malonaldehyde，MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH）检测试剂盒、羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）检测试剂盒购自南京建成生物技术有限公司；肿瘤坏死因子-α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）检测试剂盒、组织总蛋白和核蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、G/A beads购自江苏海门碧云天生物技术研究所；小鼠胰岛素ELISA试剂盒购自美国Millipore公司；腺苷酸活化蛋白激酶（AMP- activated proteinkinase，AMPK）抗体、磷酸化AMPK（p-AMPK）抗体、组蛋白H₂A抗体、核因子E2相关因子（nuclearfactor E2-related factor 2，Nrf2）抗体、乙酰化肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）抗体、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1）抗体购自美国CST公司；脂肪酸合成酶（fattyacid synthase，FASN）抗体（批号10624-2-AP）、肉毒碱棕榈酰基转移酶1α（carnitine palmitoyltransferase 1α，CPT1α）抗体（批号15184-1-AP）、转化生长因子-β（transforminggrowth factor-β，TGF-β）抗体（批号21898-1-AP）、α平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（批号55135-1-AP）、α-tublin抗体（批号11224-1-AP）购自美国ProteinTech公司；p65抗体、乙酰化p65抗体、过氧化物酶体增殖激活受体α（peroxisomeproliferator-activated receptor α，PPARα）抗体、sirtuin 1（SIRT1）抗体购自美国Abcam公司；LKB1抗体、p-LKB1抗体购自美国Santa cruz公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3- phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗体购自康成生物工程有限公司；山羊抗小鼠IgG抗体购自美国LI-COR公司。

1.3 仪器

       冰冻切片机（美国Beckman Coulter公司）；电泳及转膜系统（美国Bio-Rad公司）；Synergy H1全功能微孔板检测仪（美国Bio-TEK公司）；显微镜（日本Olympus公司）。

2  方法

2.1  分组、造模与给药

       12月龄LDLr^−/−小鼠随机分成对照组、模型组、白藜芦醇（200 mg/kg）组和虎杖苷低、高剂量（100、200 mg/kg）组^[4-5,8]，每组8只。白藜芦醇溶于0.5%羧甲基纤维素钠配制成质量浓度为20 mg/mL的溶液，虎杖苷溶于0.5%羧甲基纤维素钠分别配制成质量浓度为10、20 mg/mL的溶液。对照组给予常规饲料喂养，其余各组给予高脂饲料喂养；各给药组ig相应药物，对照组和模型组ig 0.5%羧甲基纤维素钠，1次/d，连续12周。

2.2  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠代谢参数的影响

       给药结束后，小鼠禁食12 h，自由饮水，称定质量。按试剂盒说明书检测胰岛素水平；采用全自动生化分析仪测定血糖水平；眼眶取血，按试剂盒说明书检测血清中TG、TC和FFA水平。

2.3  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织病理变化的影响

       末次给药24 h后，小鼠脱颈椎处死。取各组小鼠肝脏组织，以生理盐水洗涤，于4%多聚甲醛中固定，分别进行油红O染色、HE染色和Masson染色，于显微镜下观察并拍照。

2.4  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织脂质水平的影响

       取各组小鼠肝脏组织，按试剂盒说明书检测肝脏组织中TG和TC水平。

2.5  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织TNF-α和IL-6水平的影响

       取各组小鼠肝脏组织，按试剂盒说明书检测肝脏组织中TNF-α和IL-6水平。

2.6  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织SOD、CAT、GSH活性以及MDA、HYP水平的影响

       取各组小鼠肝脏组织，按试剂盒说明书检测肝脏组织中SOD、CAT、GSH活性以及MDA、HYP水平。

2.7  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织乙酰化LKB1和LKB1表达的影响

       G/Abeads和LKB1抗体于PBS溶液（pH＝8.2）中4 ℃孵育2 h，用dimethylpimelimidate-Cl在三乙醇胺（pH 8.2）中悬浮，室温孵育30 min；G/A beads在Tris缓冲液中悬浮15 min，用含5%聚山梨酯-20的Tris缓冲液（pH 8.0）洗涤与LKB1抗体交联的G/A珠，洗涤3次，10min/次，4 ℃用封闭溶液悬浮。免疫沉淀珠用裂解缓冲液洗涤4次，用30 μL十二烷基磺酸钠样品缓冲液洗脱，用乙酰化LKB1和LKB1抗体进行免疫印迹。

2.8  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织AMPK、p-AMPK、Nrf2、SCD1、FASN、CPT1A、TGF-β、α-SMA、p65、乙酰化p65、PPARα、SIRT1、LKB1和p-LKB1蛋白表达的影响

       按试剂盒说明书提取肝脏组织总蛋白和核蛋白，按BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入封闭液4 ℃孵育过夜；洗涤后，分别加入FASN、SCD1、PPARα、CPT1A、GAPDH、α-tublin、H₂A、Nrf2、TGF-β、α-SMA、SIRT1、LKB1、p-LKB1、AMPK、p-AMPK、p65和乙酰化p65抗体，4 ℃孵育过夜；洗涤后，加入山羊抗小鼠IgG抗体，室温孵育2 h，洗涤后，采用ODYSEEY扫描仪显影，并用图像分析系统进行灰度分析。

2.9  统计学分析

       数据以表示，采用Graphpad Prism 5软件进行单因素方差分析，采用Newman-Keuls multiple comparison test进行组间比较。

3 结果

3.1  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠代谢参数的影响

如表1所示，与对照组比较，模型组小鼠体质量显著增加（P＜0.05），血清中TC、TG和FFA水平显著升高（P＜0.05），血糖和胰岛素水平均显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，虎杖苷高剂量组和白藜芦醇组小鼠体质量明显降低（P＜0.05），各给药组小鼠血清中TC、TG和FFA水平均显著降低（P＜0.05），虎杖苷高剂量组和白藜芦醇组小鼠血糖和胰岛素水平显著降低（P＜0.05）。

3.2  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织病理变化的影响

如图1所示，与对照组相比，模型组小鼠肝脏油红O染色面积及颜色深度均增加，提示肝脏出现明显脂质聚积；各给药组小鼠肝脏油红O染色面积及颜色深度均降低。HE染色结果显示，对照组小鼠肝脏细胞排列整齐，细胞质均匀；模型组小鼠肝脏细胞胞质内存在大量大小不一的脂滴空泡，可见气球样变；各给药组小鼠肝脏病理表现均有所缓解。Masson染色结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肝脏表现出广泛的纤维化；各给药组小鼠肝纤维化明显减轻。

3.3  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织脂质水平的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏中TC和TG水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠肝脏中TC和TG水平显著降低（P＜0.05）。

如图3所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏中FASN和SCD1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），PPARα和CPT1α蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠肝脏中FASN和SCD1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），虎杖苷高剂量组和白藜芦醇组PPARα和CPT1α蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），虎杖苷低剂量组PPARα蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。

3.5 虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织炎性反应、氧化应激和胶原沉积的影响

如表2所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏中TNF-α和IL-6水平显著升高（P＜0.05），MDA水平显著升高（P＜0.05），抗氧化物酶SOD、CAT和GSH活性显著降低（P＜0.05），胶原沉积标志物HYP水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠肝脏中TNF-α和IL-6水平均显著降低（P＜0.05），MDA水平显著降低（P＜0.05），SOD和GSH活性显著升高（P＜0.05）；虎杖苷高剂量组和白藜芦醇组小鼠肝脏中CAT活性显著升高（P＜0.05），HYP水平显著降低（P＜0.05）。

3.6  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织Nrf2蛋白表达的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏Nrf2入核表达显著减少（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠肝脏Nrf2入核表达显著增加（P＜0.05）。

3.7  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织TGF-β和α-SMA蛋白表达的影响

如图5所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏中促纤维化关键因子TGF-β和α-SMA蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠肝脏中TGF-β和α-SMA蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。

3.8  虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏组织中SIRT1信号通路相关蛋白表达的影响

如图6-A所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏中SIRT1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组肝脏中SIRT1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。SIRT1主要通过对底物靶点去乙酰化产生作用，且LKB1调控AMPK。如图6-B所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏LKB1乙酰化水平显著升高（P＜0.05），p-LKB1/LKB1和p-AMPK/AMPK蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，虎杖苷高剂量组和白藜芦醇组肝脏LKB1乙酰化水平显著降低（P＜0.05），p-LKB1/LKB1和p-AMPK/AMPK蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。如图6-C所示，与对照组比较，模型组p65乙酰化水平和p65入核表达均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组p65乙酰化水平和p65入核表达均显著降低（P＜0.05）。

4  讨论

NASH是一种多方面的疾病，由于代谢并发症并存，其治疗复杂。由于大多数NAFLD/NASH患者伴有代谢综合征，理想的NASH动物模型应具有与人类NASH疾病发展相似的生理学变化如体质量增加、血脂紊乱、胰岛素抵抗、脂肪细胞因子的释放等，以及与人类NASH相似的不同阶段中的病理学模式和组织学变化等。常见的NASH模型为蛋氨酸胆碱缺乏饮食、肝脏化学毒素如CCl₄等诱导的动物模型。蛋氨酸胆碱缺乏饮食会诱导动物高代谢和低吞咽，导致血浆TG水平明显降低、体质量减轻、肝细胞气球状变小；肝脏化学毒素如CCl₄也会导致小鼠体质量减轻，与NASH的病因和病理表现不一致^[9-10]。以上模型与以高脂血症、肥胖为主的代谢综合征或糖尿病患者的NASH有很大不同，近年遗传模型在NASH研究中被广泛应用，db/db或ob/ob小鼠会出现代谢综合征和肝脂肪变性，但不会出现肝纤维化和炎性反应^[1,9]。基于NASH与动脉粥样硬化机制的相似性，脂蛋白功能受损的基因小鼠模型被应用于NASH研究。研究发现，给予中年（12月龄）雄性LDLr^−/−小鼠高脂饮食喂养，可以在代谢综合征的背景下发展为NASH，满足5项人类代谢综合征标准中的4项，并具有人类NASH的关键特征如肝脂肪变性、炎性反应、氧化应激和纤维化，且呈年龄相关性^[10]。因此，本研究采用高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠形成的代谢综合征模型探究虎杖苷对NASH的作用。

肥胖、血脂异常、空腹血糖升高和胰岛素升高是NASH患者的主要代谢综合征特征。结果显示，虎杖苷明显抑制高脂饲料喂养的中年LDLr^−/−小鼠血脂紊乱，减轻体质量，降低血糖和胰岛素水平，表明虎杖苷能够改善代谢综合征小鼠模型的代谢基础特征参数。NASH的病理发展涉及多重打击，肝脏脂肪变性使肝细胞易受到其他刺激，从而导致肝脏炎性反应、损伤和纤维化^[1,3]。结果显示，高脂饲料喂养的中年LDLr^−/−小鼠肝脏出现明显脂肪变性，虎杖苷明显减少肝脏脂肪变性。脂肪酸的从头生成和β-氧化是脂质代谢的2个关键作用。新生脂肪生成受一系列脂酶如FASN和SCD1的调控。PPARα和CPT1α是脂肪酸β氧化的2个关键酶^[11]。本研究结果显示，虎杖苷显著降低肝脏中FASN和SCD1蛋白表达水平，提高PPARα和CPT1α蛋白表达水平，提示虎杖苷通过调节脂肪酸的新生脂肪生成和β-氧化，有助于减轻血脂异常和肝脂肪变性。

炎性反应可以通过激活肝星状细胞和纤维化，在NASH发展中发挥主导作用，为NASH与肝脏的单纯性脂肪变性的主要区别。结果显示，虎杖苷抑制肝脏炎性因子TNF-α和IL-6水平，表明虎杖苷可以改善肝脏炎性反应，有助于抑制NASH进程。多种内源性和外源性损伤、线粒体呼吸链衰竭、抗氧化元素如SOD、CAT活性或脂质过氧化水平升高的过度生成，能够导致持续性肝损伤、凋亡、炎性反应和纤维化。结果显示，虎杖苷抑制中年LDLr^−/−小鼠肝脏脂质过氧化的最终产物MDA水平，增强肝脏抗氧化应激的主要抗氧化酶SOD、GSH和CAT活性。Nrf2是抗氧化机制的关键调节器，作用于多种抗氧化物酶，为潜在的治疗NAFLD/NASH的靶点^[12]。结果显示，虎杖苷能够促进Nrf2入核表达，从而增加抗氧化酶活性。在炎性反应和慢性肝损伤过程中，肝星状细胞通过产生异常数量的细胞外基质而被激活，并向肌纤维样细胞转化，从而导致肝纤维化。本研究结果显示，虎杖苷显著抑制肝脏胶原沉积和纤维化相关蛋白TGF-β和α-SMA表达，从而抑制肝脏纤维化。

SIRT1是肝脏脂质代谢、氧化应激和炎性反应的重要调节因子，可以预防和改善NAFLD/NASH的特征^[13]。SIRT1激活剂白藜芦醇能够通过SIRT1介导的信号转导途径改善NAFLD^[14]。结果显示，虎杖苷显著增强高脂喂养中年LDLr^−/−小鼠肝脏中SIRT1蛋白表达水平。SIRT1作为1种依赖于NAD 的脱乙酰化酶，催化组蛋白的脱乙酰化，也能够使非组蛋白底物去乙酰化。LKB1和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是由SIRT1介导的去乙酰化调节代谢和细胞应激反应的转录调节因子。SIRT1通过在Lys48处使LKB1去乙酰而作用于AMPK信号的上游，并激活LKB1，导致p-AMPK表达增加^[13-14]。AMPK是肝脏脂质代谢的重要调节因子，AMPK的激活能够抑制下游靶点FASN和SCD1，从而抑制脂肪的从头合成；AMPK的激活可以增强CPT1表达，增加肝脏脂肪酸β-氧化；AMPK调节脂肪酸β-氧化的另1个重要分子PPARα^[11]。因此，SIRT1/LKB1/AMPK通路在肝细胞脂质代谢中起重要作用。结果显示，虎杖苷显著增强LKB1去乙酰化水平和AMPK磷酸化水平，从而抑制AMPK靶基因FASN和SCD1参与脂肪的从头生成，促进PPARα和CPT1α参与脂肪酸β氧化，改善肝脏脂肪代谢、减轻肝脏脂肪变性。NF-κB是炎性反应的主要调节因子，RelA/p65是NF-κB最常见的杂二聚体。SIRT1能够使RelA/p65亚基的赖氨酸310去乙酰，促进p65/p50复合物结合，使NF-κB转录活性失活，抑制其促炎靶基因的表达^[15]。结果显示，虎杖苷降低p65乙酰化水平，即增加了p65的去乙酰化，从而抑制p65入核表达，抑制炎性反应。Nrf2与AMPK、NF-κB信号通路相互影响^[16-17]，虎杖苷对Nrf2的调控可能与其对AMPK和NF-κB信号通路的调控密切相关。

综上所述，本研究发现虎杖苷能够减轻高脂喂养的中年LDLr^−/−小鼠形成的代谢综合征模型中NASH，即改善代谢参数、脂肪变性、炎性反应、氧化应激和纤维化，以上作用可能与肝脏SIRT1的激活有关。虎杖苷能够通过调控肝脏脂质代谢相关蛋白如p-AMPK、FASN、SCD1、PPARα、CPT1表达减轻肝脏脂肪变性，通过增强Nrf2抗氧化信号通路减轻肝脏氧化应激，通过抑制转录因子p65活化减轻肝脏炎性反应，通过抑制促纤维化关键蛋白TGF-β和α-SMA表达减轻肝脏纤维化。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略） 

来  源：吉秋霞，许晓乐．虎杖苷对高脂喂养的中年LDLr−/−小鼠非酒精性脂肪肝炎的作用及机制研究   [J]. 中草药, 2021, 52(12): 3602- 3610.