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1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物
90 只 SPF 级 6 周龄性成熟 BALB / c 雌小鼠,体 重 18 ~ 20 g, 温度 22 ~ 25℃ ,湿度 55% ~ 60%,12 h光照和12 h 黑暗交替,实验前适应性饲养 1 周。
1. 1. 2 试剂与仪器
苯甲酸 β-雌二醇( Sigma,E2758),实验用芝麻油(Acros organics,241002500)
两套眼科常规手术器械(剪刀、镊子、止血钳)、 注射用生理盐水、1 mL 注射器、20 mL 注射器等。
1. 2. 1 药物配制
称取 1. 5 mg 苯甲酸 β-雌二醇粉末以 50 mL 实 验用芝麻油溶解,配成浓度为 30 μg / mL 的苯甲酸 β -雌二醇溶液置 4℃冰箱避光保存备用。
1. 2. 2 实验分组
造模前,每日定时对所有小鼠进行阴道脱落细 胞涂片(美蓝染色法),连续观察两个动情周期,选 取动情周期规律的小鼠用于实验。 90 只实验小鼠 中 48 只用于子宫内膜异位症模型建立,32 只作为 假手术组,另外 10 只作为空白对照,用于模型对比 鉴定。 用于模型建立的 48 只小鼠按照 1 ∶ 2的比例 随机分为供体鼠 16 只和受体鼠 32 只。 32 只受体 小鼠随机分为 4 组,每组 8 只,分别为种植后 1 周 组、种植后 2 周组、种植后 4 周组和种植后 6 周组。
1. 2. 3 建模方法
所述模型的建立方法,按如下步骤操作:
(1) 注射雌激素:所有实验小鼠(包括供体鼠和 受体鼠) 颈背部皮下注射苯甲酸雌二醇溶液 150 μg / kg,每 4 天注射 1 次,共注射两次。
(2) 从注射雌激素开始至腹腔种植当日,每日 定时对供体鼠和受体鼠进行阴道脱落细胞涂片检 查,观察小鼠动情周期。 动情周期判断依据如下: 动情前期:圆形或椭圆形的有核上皮细胞为主,夹 有少量角化细胞和白细胞;动情期:几乎全是无核 的角化细胞;动情后期:角化细胞减少,出现有核上 皮细胞和白细胞;动情间期:细胞少而皱缩,白细胞为主。
(3) 种植前标本准备:供体小鼠的子宫取出用 预冷的生理盐水清洗血液和粘液,将子宫一分为二 分别放入盛有 0. 5 mL 预冷的 RPMI1640 培养基的 培养皿中,用眼科剪将子宫纵向剖开,剥离子宫内 膜层并迅速将其剪成体积 ≤ 1 mm 3 的内膜碎片制 成悬浮液备用。
(4) 腹腔注射内膜:受体小鼠腹部皮肤消毒后, 以 1 mL 注射器针筒接 20 mL 注射器针头,以小鼠下 腹部正中尿道口上方 0. 5 cm 处为进针点,将子宫内 膜碎片注射入受体小鼠腹腔,针孔处涂抹适量青霉 素软膏预防感染,供体鼠与受体鼠数量比为 1 ∶ 2。 从取出供体小鼠子宫到注射子宫内膜碎片入受体 小鼠所有操作应在 5 min 内连续完成,全程保持无 菌。 假手术组注射雌激素的方法与模型组相同,不 同的是,假手术组腹腔注射的是等体积的供体小鼠 的腹腔脂肪组织。
(5) 种植后处理:腹腔种植内膜当日开始对受 体小鼠颈背部皮下注射苯甲酸β-雌二醇溶液 150 μg / kg,每 4 天注射 1 次,共注射两次,之后待内膜自 然生长。
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