醋酸对免疫球蛋白a的功能调控 - -阐明与控制肠道细菌相关的新分子机制-

物理化学研究所 株式会社大赛璐 日本医疗研究开发机构 醋酸对免疫球蛋白a的功能调控 - -阐明与控制肠道细菌相关的新分子机制-

理化学研究所(理研)生命医学科学中心粘膜系统研究小组的竹内直志研修生、大野博司小组组长等国际共同研究小组发现，肠道细菌的主要代谢物“醋酸”通过改变“免疫球蛋白A(IgA ) [1]”的细菌反应性而参与肠道细菌的控制。

本研究成果显示，肠内细菌通过其代谢物在IgA的功能控制中发挥着重要的作用，今后，通过加深对IgA功能控制的理解，期待着开发出肠内细菌的新控制方法。 IgA是以肠内细菌为靶向的主要免疫球蛋白，但IgA与肠内细菌的相互作用是如何调控的尚不清楚。 这次，国际联合研究小组表明，由醋酸诱导的IgA与大肠菌等病原性单侧共生细菌[2]结合，阻止侵入大肠表面的粘液层。 他还表明，作为其作用机理，强化醋酸与菌体成分[3]一起支持IgA产生的CD4阳性t细胞[4]的功能，从而增加大肠杆菌反应性的IgA。 认为免疫系统通过刺激肠内细菌代谢物来改变IgA产生的模式，从而控制肠内细菌。 本研究刊登在科学杂志《Nature》在线版( 7月14日:日本时间7月15日)上。

醋酸通过改变IgA的肠内细菌反应性的平衡来控制肠内细菌

背景 我们人类肠道里生活着长达40兆的细菌，它们被称为肠内细菌。 肠道细菌通过产生人类不可缺少的营养素，排除外来的病原菌，为维持人类的健康做出了贡献。 另一方面，如果不能控制过剩的细菌，也有可能会引起伴随细菌体内转移而产生的感染症，因此，阐明肠内细菌的控制机制是与细菌共生关系中的重要课题。 另外，近年来，明确了肠内细菌与中枢神经和肥胖、糖尿病等各种全身疾病有关，也显示了通过控制肠内细菌来改变疾病敏感性的可能性。 “免疫球蛋白A(IgA )”是人类体内产生最多的免疫球蛋白，主要由肠道等粘膜面分泌。 IgA通过与肠内细菌结合，被认为控制着肠内细菌的增殖·固定功能。 但是，没有发现IgA如何应对动态变化的肠内环境，调节对肠内细菌的反应性。 从近年的报告中可以看出，肠内细菌产生的代谢物对肠道的免疫功能产生了很大的影响。 已知特别是肠内细菌的主要代谢物“短链脂肪酸[5]”与控制性t细胞和自然淋巴细胞等多种免疫细胞的诱导功能相关。 关于IgA，很久以前就表明了短链脂肪酸有增加其分泌量的可能性。 因此，这次建立了短链脂肪酸是否也参与IgA的功能控制的假说，并进行了实验验证。

研究方法和成果

国际共同研究小组首先给老鼠喂了一种在肠道内使短链脂肪酸特异性增加的叫做“短链脂肪酸附加纤维素”的饲料，在大肠局部提高了短链脂肪酸的浓度。 结果表明，通过施用附加了短链脂肪酸之一“醋酸”的纤维素(醋酸纤维素)，IgA产生细胞和IgA分泌量增加，另外，IgA对肠内细菌的结合率也增加(图1 )。 另一方面，同样也调查了其他短链脂肪酸丙酸、丁酸的效果，但IgA的量等没有发生变化。立了短链脂肪酸是否也参与IgA的功能控制的假说，并进行了实验验证。

图1醋酸引起的IgA产生及肠内细菌结合率的增加

a:通过投用醋酸纤维素，小鼠粪便中的肠道分泌IgA增加。

b :通过投放醋酸纤维素，IgA对小鼠粪便中细菌的结合率上升。 **P < 0.01

然后，利用IgA测序[6]，调查了伴随醋酸纤维素给药的大肠内IgA结合细菌的模式变化。 结果表明，控制小鼠的IgA多与巴氏杆菌目等一般共生细菌结合，而给醋酸纤维素小鼠的IgA则与属于细菌丛的大肠杆菌等病原性单侧共生细菌结合(图2 )。

图2醋酸引起的IgA结合细菌模式的变化 左:一般的共生细菌- -细菌芽孢杆菌目的IgA非结合和IgA结合的比例。 IgA结合的比例，控制小鼠比给醋酸纤维素的小鼠高。 右: IgA非结合和IgA结合在大肠杆菌等病原性单倍体共生细菌Enterobacterales眼中的比例。 投用醋酸纤维素的小鼠IgA键的比例比控制小鼠高。 * * p <0. 05，**P < 0.01。

为了验证该IgA测序的结果，制作了将大肠杆菌( E. coli )或一般共生细菌的Bacteroid es thetaiotaomicron ( b.theta )分别固定在无菌小鼠[7]肠道内的小鼠 结果表明，只有在大肠杆菌固定的小鼠中，大肠内的IgA才会增加(图3a )。 另外，将经过加热杀菌处理的大肠杆菌喂入无菌小鼠时，IgA也有所增加(图3b )。 以上结果表明，醋酸纤维素对IgA的效果依赖于构成肠内细菌的菌体成分，特别是对病原性单侧共生细菌产生IgA。

图3醋酸引起的肠内细菌依赖性IgA产生的增加 a :在a:B. theta定影的小鼠中，没有发现通过控制和投用醋酸纤维素产生的IgA反应性的差异(左)，但是在大肠杆菌( E. coli )定影的小鼠中，通过投用醋酸纤维素增加了IgA反应性(右)。 b :在给与加热杀菌处理B. theta的无菌小鼠中，没有发现控制和给与醋酸纤维素产生IgA的差异，但给与加热杀菌处理大肠杆菌( E. coli )的无菌小鼠中，通过给与醋酸纤维素增加了IgA的产生。 * * p <0. 05，**P < 0.01

接着，调查了通过醋酸纤维素在大肠增加的IgA在肠道内的功能。 野生型小鼠中，特别是大肠表面粘液层的肠内细菌组成因醋酸纤维素而发生了变化，与此相对，无法产生IgA的AID缺失小鼠[8]即使投用醋酸纤维素，粘液层的肠内细菌组成也没有发生变化。 另外，给小鼠注射绿色荧光阳性大肠杆菌[9]时，发现通过醋酸纤维素增加的IgA与大肠杆菌结合，特别是阻止了其侵入粘液层(图4 )。 以上结果表明，由醋酸纤维素诱导的大肠内的IgA，可以阻止病原性单侧共生细菌在粘液层的固定入侵。

图4乙酸和IgA对大肠杆菌侵入粘液层的效果 通过施用醋酸纤维素，减少了大肠粘液层中绿色荧光阳性大肠杆菌的相对存在量。 *P < 0.05。

最后，调查了醋酸纤维素对特定细菌诱导IgA的作用机理。 IgA产生有两种途径:需要支持CD4阳性t细胞的途径( t细胞依赖性IgA产生[10] )和不需要的途径( t细胞非依赖性IgA产生)。 于是，首先在试管内向b细胞[10]中添加乙酸钠和加热处理过的大肠杆菌( E. coli )或B. theta，与CD4阳性t细胞一起培养。 结果表明，在醋酸和大肠杆菌的刺激下，IgA产生细胞增加(图5a )。 另一方面，乙酸在与B. theta的共刺激下，没有使IgA产生的细胞增加(图5a )。 接着，利用缺失菌体成分受体Toll样受体[11]的myd 88 trif双重缺失小鼠，验证了菌体成分对CD4阳性t细胞的刺激是否会影响IgA的产生。 向没有t细胞的CD3ε缺失小鼠移植从野生型小鼠和myd 88 trif双重缺失小鼠中提取的CD4阳性t细胞，给这些小鼠注射了醋酸纤维素。 结果显示，野生型小鼠来源的具有CD4阳性t细胞的小鼠，与此前的结果一样，通过投用醋酸纤维素发现IgA产生增加及大肠杆菌反应性IgA增加，而来自myd 88 trif双重缺失小鼠的带有CD4阳性t细胞的小鼠在IgA产生上未见差异(图5b )。

图5乙酸和菌体成分引起的CD4阳性t细胞介导的IgA反应性的变化 a:乙酸钠和加热处理的大肠杆菌( E. coli )依赖于CD4阳性t细胞使IgA产生的b细胞增加，但是在乙酸钠和加热处理的B. thetaiotaomicron(B. theta )的共同刺激中没有发现变化 b :通过投用醋酸纤维素，野生型小鼠来源的CD4阳性t细胞的移植小鼠中，大肠杆菌( E. coli )反应性IgA增加。 另一方面，来自MyD88/TRIF双重缺失小鼠的CD4阳性t细胞的移植小鼠中大肠杆菌( E. coli )反应性IgA没有变化。 * * p <0. 05、**P < 0.01、***P < 0.001。

以上结果表明，醋酸与菌体成分一起刺激CD4阳性t细胞，从而依赖t细胞增加大肠杆菌反应性的IgA产生(图6 )。

图6本研究结果概要 作为肠内细菌代谢物的醋酸，与大肠菌的菌体成分一起强化CD4阳性t细胞的功能，从而增加t细胞依赖性IgA的产生，结果改变对肠内细菌的IgA反应性的平衡。 乙酸特别是对大肠杆菌等特定致病性单益共生细菌增加IgA的产生。

今后的期待 以往的报告暗示，即使是同一种细菌，在特定的环境下也不会与IgA结合或不结合，但尚不清楚为什么IgA和肠内细菌的相互作用会发生变化，以及如何控制。 本研究表明，作为肠内细菌代谢物的醋酸与肠内细菌菌体成分一起增强t细胞依赖性IgA的产生，从而改变IgA的平衡，醋酸特别是通过增加病原性单侧共生细菌的IgA产生，从而影响细菌肠道内定位。 研究表明，肠内细菌不仅会参与消化道，还会涉及中枢神经和肥胖、糖尿病等各种疾病。 因此，认为控制肠内细菌将导致新的治疗方法。 IgA是控制肠道细菌的主要免疫系统，了解IgA和肠道细菌的相互作用，有望在未来实现肠道细菌控制和疾病防治。

补充说明 1 .免疫球蛋白A(IgA ) b细胞产生的免疫球蛋白分为m、d、g、e、a五类。 其中，IgA是生物体内产生最多的免疫球蛋白，主要由肠道等粘膜面分泌。 一般认为，IgA通过与肠内细菌结合，参与肠内细菌的入侵、定居、增殖的控制。 可以认为，根据各种b细胞产生的IgA的平衡，也规定了与整体IgA结合的肠内细菌的平衡。 2 .病原性单利共生细菌 与宿主共生的细菌中，只有在特定的环境下才能对宿主产生不良影响的细菌。 大肠杆菌等。 3 .菌体成分 是构成细菌的成分，具有活化免疫细胞的作用。 代表性的有细胞壁成分脂多糖、脂多糖、还有鞭毛成分的铁蛋白等。 4.CD4阳性t细胞 表达CD4的t细胞，一般称为辅助性t细胞。 通过产生细胞因子来支持b细胞的活性化，除此之外还参与各种免疫功能的活性化，起到免疫司令塔的作用。 5 .短链脂肪酸 一般是指碳原子数6以下的直链状脂肪酸。 肠道细菌产生的主要有机酸。 乙酸、丙酸、丁酸等。 根据过去的研究，知道了对免疫系统的各种效果。 6.IgA测序 通过调查与用荧光色素标记的IgA的结合，可以判别与IgA结合的细菌和未结合的细菌。 用流式细胞术等可以分析荧光色素的仪器分别回收这些细菌，再用新一代测序仪分析各个肠内细菌丛的方法。 7 .无菌小鼠 完全不存在肠道细菌和皮肤表面等常驻细菌的老鼠。 由于动物在子宫内处于无菌状态，通过剖腹产无菌取出小鼠，再通过无菌操作送入被称为无菌隔离器的能够无菌保持内部的特殊饲养装置进行饲养，从而获得动物。 8.AID缺失小鼠 通过基因重组使活化诱导胞苷脱氨酶( AID )缺失的小鼠。 AID是抗体类开关及体细胞超微变异所必需的，在AID缺失的小鼠中未见IgA、IgE、IgG等类开关产生的抗体。 9 .绿色荧光阳性大肠杆菌 从水母中鉴定的表达绿色荧光蛋白质的大肠杆菌。 给小鼠注射该大肠杆菌，可以从图像上分析其在肠道内的定位，而且也可以通过流式细胞术等分析荧光色素的仪器进行定量。 10.T细胞依赖性IgA产生，b细胞 所谓产生t细胞依赖性IgA，是指IgA产生路径中需要CD4阳性t细胞的介入。 CD4阳性t细胞通过接受抗原提示而被活化，接着通过将该信息传递给b细胞而b细胞被活化。 承担抗体产生功能的b细胞通过活性化，分化成更有效地分泌抗体的浆细胞。 一般认为，由于t细胞依赖性IgA的产生，会产生高亲和性的IgA。 另一方面，也存在产生t细胞非依赖性IgA的路径，在这种情况下，b细胞会由于树突状细胞等其他细胞的刺激而被活化。 11.Toll样受体 是脂多糖等菌体成分的受体，通过识别菌体成分的模式来激活免疫细胞。 传递其受体信号的分子为MyD88和TRIF。 在MyD88、TRIF均缺失的小鼠中，由于不能传递Toll样受体的信号，所有的Toll样受体都失去了功能。

国际联合研究小组 理化学研究所生命医生科学研究中心 粘膜系统研究小组 队长大野博司 研修生/研究钟点工ⅰ竹内直志 研究员宫内荣治 高级研究员金谷高史 研究员加藤完 研究员中西裕美子 客座研究员对田尚 基础科学特别研究员佐佐木崇晴 研究生(研究当时)根岸纮生 综合基因组学研究小组 小组组长(研究当时)小原收 高级研究员(研究当时)渡边贵志(渡边贵志) 代谢网络研究小组 队长北见俊守 株式会社大赛璐 事业创造总部事业创造中心 主席部员岛本周 保健SBU事业推进室事业战略小组 顾问松山彰收 京都大学研究生院生命科学研究科生物系统学 教授木村郁夫 埃默里大学医学院病理学教室 伊福·威廉斯教授( Ifor R. Williams )

研究支援 本研究由理化学研究所共生生物学项目、日本学术振兴会( JSPS )科学研究费补助金青年研究( b )“肠内细菌对中枢神经系统炎症控制机制的分析(研究代表者:宫内荣治)”、 以及日本医疗研究开发机构( AMED )创新性尖端研究开发支援事业( AMED-CREST )“基于疾病代谢产物的分析和代谢控制的创新性医疗基础技术的创造”研究开发领域(研究开发总结:清水孝雄)的研究开发课题名称“基于混合分析的过敏发病机构”

原论文信息

Tadashi Takeuchi, Eiji Miyauchi, Takashi Kanaya, Tamotsu Kato, Yumiko Nakanishi, Takashi Watanabe, Toshimori Kitami, Takashi Taida, Takaharu Sasaki, Hiroki Negishi, Shu Shimamoto, Akinobu Matsuyama, Ikuo Kimura, Ifor R. Williams, Osamu Ohara, Hiroshi Ohno, "Acetate differentially regulates IgA reactivity to commensal bacteria", Nature, 10.1038/s41586-021-03727-5

发表者 物理化学研究所 生命医学科学研究中心粘膜系统研究小组 研修生竹内直志 队长大野博司