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肺癌的早期诊断 Early Diagnosis of Lung Cancer 孙丹雄 云南省一院，呼吸科 原发性肺癌是中国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，由于侵袭性高，且缺乏有效的早期发现手段，导致中国大部分肺癌患者就诊时已是晚期，即Ⅳ期[1]。由于早期诊断不及时，肺癌病人确诊后5年生存率仅14%；假如确诊时肺癌病变局限，则5年生存率高达50%。由此可见，探索肺癌的早期诊断方法十分重要。 一、影像学检查 目前世界范围内基本都是采用有辐射的X线检查筛查肺癌。 X线胸片辐射小，且能够提高肺癌的检出率，但其缺点也很明显，即大多数小于1cm的结节在X线胸片上不显示[2]。另外，有研究显示，X线胸片筛查不能降低肺癌的死亡率[3]。 胸部CT诊断早期肺癌的敏感性和特异性均优于胸片。2011年，首次由随机对照试验研究证实，在高危人群中，与X线胸片比较，低剂量螺旋CT（LDCT）可降低20%的肺癌死亡率[4]。然而，低剂量CT也有一些潜在的危害：①假阳性率过高，从而导致不必要的有创检查、患者焦虑以及医疗资源的浪费；②辐射，特别是对于肺癌发病危险较低的个体，有研究显示，年龄在50岁以下的人群中，归因于低剂量CT筛查的死亡率的降低程度并未超过辐射的危险[5]。在我国，低剂量CT筛查肺癌是否符合经济效益仍有待探索。 二、呼吸内镜及介入诊疗技术 对于支气管腔内比较小的病灶，CT难以显示或容易漏诊，普通支气管镜可发现部分被漏诊的病灶，自荧光支气管镜能够通过荧光色彩的不同直观地区别癌前病变和原位癌等普通白光支气管镜所不易发现的病灶，提高早期肺癌的检出率，但呼吸内镜为有创检查，且不适合用于肺癌的筛查。一项Meta分析显示，对于周围型肺部病灶，特别是≤20mm的病灶，即使使用目前先讲的支气管内超声、虚拟导航气管镜、电磁导航气管镜等气管镜检查技术，诊断率也仅有61%[6]。CT引导下肺穿刺活检的敏感性及特异性均较高，但风险颇多，气胸发生率较高，少数情况下可导致危及生命的大咯血及空气栓塞。 三、生物标志物 目前尚无特异性的生物标志物应用于肺癌的临床诊断，大多数都处于研究阶段[7]。 3.1血清肿瘤标记物 目前尚未发现对各型肺癌均具有高度敏感性和特异性的肿瘤标志物。血清肿瘤标记物联合检测可提高检测方法的敏感性和准确性，有利于肺癌的早期诊断，但总体而言准确性不理想。胃泌素释放肽前体、神经特异性烯醇化酶、癌胚抗原、细胞角蛋白片段19、鳞状细胞癌抗原等肿瘤标记物可用于随访，如果在随访阶段发现上述肿瘤标志物有进行性增高，需要警惕早期肺癌。 3.2循环肿瘤细胞 Ashworth于1869年发现肿瘤患者外周血中存在一种细胞与肿瘤细胞相似，遂提出了循环肿瘤细胞 (circulating tumor cell，CTC)的概念。然而，直到2003年CTC才被完全定义:一方面为原发灶或转移灶的肿瘤细胞通过毛细血管进入血液循环系统形成，另一方面为肿瘤细胞获得间质上皮转化使得细胞的侵袭能力增强入侵基底膜而形成[8]。单细胞测序技术的发展证实，CTC与肿瘤原发灶和转移灶存在相似的基因谱，且在肺癌的早期阶段即可进入血液循环，对于肿瘤的早期诊断具有重要意义。 CTC的检测方法主要包括富集分离与分析鉴定两步。富集分离方法包括免疫磁珠技术、微流控芯片技术、滤过膜分离法、基于密度梯度的离心技术等。分析鉴定方法包括核酸检测技术、免疫组织化学法、荧光显微技术等。另外，目前美国食品和药物管理局已批准一体自动化的CellSearch循环肿瘤细胞检测系统用于临床的诊断性试验。 无癌患者检测循环肿瘤细胞可预测肺癌：法国学者[9]对245例无癌受试者进行研究，其中168例 (68.6%)是慢阻肺，77例为无慢阻肺的健康人（其中42例吸烟、35例无吸烟），所有研究对象均采用ISET过滤富集技术检测CTC（循环肿瘤细胞）。168例慢阻肺中有5例（3%）检测到CTC，对这5例患者每年进行胸部CT扫描，随访1~4年，5例患者全部发现肺结节，随后行外科手术切除，病理均为ⅠA期肺癌，术后随访1年CTC转阴，提示CTC（循环肿瘤细胞）可在胸部CT出现病灶之前发现肿瘤。 诊断肺癌：国外有学者[10]采用过滤分离及免疫组织化学法检测CTC（循环肿瘤细胞），以CTC（循环肿瘤细胞）>25个为限定临界值，对60例肺癌和17例良性肺结节进行研究，结果示诊断的敏感性和特异性分别为89%和100%。国内李时悦等[11]对247例肺癌患者和70例良性肺部疾病患者进行研究，采集外周血和BALF标本，其中肿瘤细胞通过阴性免疫磁选择富集，并通过染色体计数探针8 (CEP8)的荧光原位杂交(FISH)检测。肺癌和良性肺疾病患者外周血肿瘤细胞数与BALF相当。检测CTC诊断肺癌的敏感性为83.8%，特异性为86.5%；检测肺泡灌洗液肿瘤细胞的敏感性为92.6%，特异性为99.9%。 缺点：循环肿瘤细胞并不能完全代表实体肿瘤，且其在血液中较为稀少，检测敏感性尚不理想。目前的阳性富集技术主要采用免疫磁珠与EpCAM相结合的方式来富集和分离CTC（循环肿瘤细胞），不过这类技术受到CTC上EpCAM 表达异质性的限制，大部分CTC从原发灶脱落或转移过程中都会发生上皮间质化(EMT)，失去了 EpCAM表达，导致无法或捕获这类CTC。目前的技术对CTC细胞追踪能力低下，也还没有针对肺癌CTC的分离富集操作标准，从而限制了其在临床实践中的广泛应用[12]。 争议：2009年日本学者的研究显示（150例患者，25例良性疾病，125例肺癌，其中31例有远处转移，94例无远处转移），虽然肿瘤患者CTC计数高于非肿瘤患者，但诊断肺癌的效能不足，ROC曲线下面积才0.598 (95% CI, 0.488-0.708; P = 0.122)，不过CTC数量随肺癌临床分期进展而增多[13]；然而，2012年美国学者研究发现（78例非小细胞肺癌），CTC在不同肺癌分期中没有数量差异[14]。 3.3循环肿瘤DNA 循环游离DNA（cell free DNA，cfDNA）是一种存在于人体体液中且游离于细胞之外的核酸，由Mandel和Metais于1948年发现，其来源主要是凋亡或坏死的细胞。1994年Vasioukhin等在肿瘤患者cfDNA中发现了肿瘤相关的RAS基因突变，这部分含有肿瘤相关突变的cfDNA称为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），为单链或双链DNA，来源于循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、凋亡或坏死的肿瘤细胞、外泌体等[15]。患者的ctDNA水平会随着肿瘤负荷的增加而升高，有学者认为，ctDNA是迄今为止可获得的癌症患者诊断、预后、以及预测信息的最佳血液分子材料[16-17]。 非小细胞肺癌患者血浆cfDNA水平升高主要是由于肿瘤的作用而非炎症反应，这对肺癌的筛查和早期诊断具有潜在的临床意义。波兰学者采用实时荧光定量PCR技术检测50例可切除NSCLC患者、101例慢性呼吸道炎症（慢性阻塞性肺疾病、结节病、哮喘）患者和40例健康志愿者血浆cfDNA浓度，NSCLC患者血浆cfDNA水平明显高于慢性呼吸道炎症患者和健康人（P<0.0001），而慢性呼吸道炎症患者与健康志愿者血浆cfDNA水平无显著性差异，临界值>2.8 ng /ml在区分NSCLC和健康个体时具有90%的敏感性和80.5%的特异性（AUC=0.90），临界值>5.25ng /ml区分NSCLC患者和慢性呼吸道炎症的AUC=0.76，具有56%的敏感性和91%的特异性[18]。 Bettegowda等[17]发现ctDNA在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期小细胞肺癌患者中的检出率分别是47%、55%、69%、82%，对早期肺癌亦有诊断价值。 国内有综述[19]写到，国外研究证实在肺癌诊断中使用特异性和敏感性的ctDNA比使用CT成像技术要早将近6～12月。但是这篇综述引用的参考文献，其研究结论是：Intratumor heterogeneity mediated through chromosome instability was associated with an increased risk of recurrence or death, a finding that supports the potential value of chromosome instability as a prognostic predictor，即：通过染色体不稳定性介导的肿瘤内异质性与复发或死亡风险增加相关，这一发现支持染色体不稳定性作为预后预测指标的潜在价值[20]。从研究结论看，与ctDNA早期诊断肺癌无关。 有研究显示，血浆、血清的ctDNA含量不同，血浆是较好的ctDNA来源，血清中的cf DNA虽然比血浆多，但血浆中的突变载荷更高，对配对的血浆/血清样品同时分析有助于提高灵敏度[21]。应用荧光定量PCR、数字PCR等技术可以对ctDNA进行定量检测，基于小珠（Bead）、乳浊液（Emulsion）、扩增（Amplification）、磁性（Magnetic）这四个主要组分构建的BEAMing技术和通过深度测序进行癌症个性化分析的CAPP-seq技术，通过使用已知的标签测序引物来扩增目标DNA，已经改变了检测ctDNA的格局。Newman等研发的ctDNA检测方法-肿瘤个体化深度测序分析法，对先前ctDNA提取方法存在的问题加以改进，增强了检测敏感性，此法对于Ⅰ期非小细胞肺癌的敏感性为50%，对于Ⅱ ～Ⅳ期的检测敏感性为100%，并且能检测到比例低至万分之二的ctDNA，AUC为0.99，此法的特点是必须已知目标基因，才能对进行定量分析[22]。 NGS可以在多个靶向基因组区域内同时进行测序，样品需求也相对较少，周转时间更短，被越来越多地用于ctDNA的分析当中。设计在Ion Torrent PGM平台（Thermofisher）中关于cf DNA常规诊断的有限NGS平台（命名为SiRe的定制基因组），可以靶向568个临床相关的突变基因，诊断的灵敏度和特异度也较高，与其他数字或非数字检测平台相当[23]。 存在的问题：目前支持ctDNA应用在肺癌早期诊断的临床数据依然有限。来自于多数肺癌患者外周血中的ctDNA量占总体cfDNA的比值小于1%，且受肿瘤分期、患者病灶部位、肿瘤负荷等因素影响，使外周血ctDNA检测存在一定的局限性，现存的技术仍无法克服敏感性分析的难关[24]。在早期肺癌患者中ctDNA的含量更低，但相较于晚期肺癌，早期肺癌对ctDNA检测的灵敏度有更高要求。NGS的使用还涉及到一些问题，如成本、所需DNA的质量以及生物信息学支持的必要性等。ctDNA检测与长期保存还存在一些技术难题。死亡的血细胞会污染ctDNA标本,而循环游离DNA（circulating cell-freeDNA，ccfDNA）与ctDNA的异质性也会干扰ctDNA 的检测分析。由于受清除速度、血容量、肿瘤的分期分级等因素的影响，不同患者不同时间测定的外周血中ctDNA水平差异很大，且早期肿瘤患者ctDNA的丰度偏低，而目前大多数的检测技术只能在血液内ctDNA丰度10%以上时，才能得到准确的肿瘤信息，ctDNA检测的可靠性和稳定性尚需进一步验证，如何将检测方法标准化是有待解决的问题。 3.4 DNA甲基化 DNA甲基化在表观遗传学研究领域中占有重要地位，在甲基化转移酶的作用下，一个甲基基团以共价键结合在基因组胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸的胞嘧啶5碳原子上，即形成DNA甲基化。抑癌基因的失活是肿瘤形成的重要分子基础，发生机制之一就是抑癌基因启动子区域高甲基化，在肺癌发病的早期就存在癌基因和抑癌基因不同程度的甲基化改变。一些基因在某类肿瘤中常被甲基化，且甲基化的DNA片段能在不同的体液中稳定存在，对特定的基因进行甲基化检测可用于协助诊断肿瘤。研究显示DNA甲基化稳定性较高，血浆和肿瘤组织的基因甲基化状态高度一致，通过PCR技术可以在血液和痰等不同标本中检测到，可能成为精确诊断早期肺癌的重要方法[25]。 预测肺癌风险：检测某些基因甲基化水平可以预测特定人群的肺癌发病风险。国内学者采用hOGG1基因甲基化特异性PCR检测121例NSCLC患者和121例正常人外周血单个核细胞的甲基化水平，hOGG1甲基化阳性携带者发生NSCLC的风险高2.25倍（校正的OR：2.247；95%CI：1.067-4.734；P=0.03）高于无甲基化的受试者[26]。 血浆中甲基化的SHOX2基因是编码DNA并结合转录因子的人类同源盒基因家族的成员，是肺癌的特异性生物标志物，与小细胞肺癌和肺鳞癌存在特异相关。有Meta分析显示，SHOX2基因甲基化辅助肺癌诊断的敏感性为70%，特异性为96%，临床分期越晚，敏感性越强[27]。 单基因甲基化诊断肺癌很难达到临床要求，例如单基因DCC的DNA甲基化检测肺癌的特异度高达100%，但敏感性只有35.5%，因为特异性较高的位点极少，且单基因阳性率不高。Weiss等[28]研究显示，血浆SHOX2基因甲基化联合前列腺素E受体4基因甲基化组合诊断肺癌的敏感性为67%，特异性为90%。国内学者[29]采用甲基化特异性PCR方法检测了78例配对NSCLC标本及癌旁正常组织、110例I/II期NSCLC和50例无癌血浆中20个抑癌基因的甲基化状态，结果示结肠腺瘤样息肉蛋白、RAS相关区域家族1A、T⁃钙黏蛋白、人组织激肽释放酶10和抑癌基因DLEC1等5个基因甲基化联合检测，诊断非小细胞肺癌（NSCLC）的敏感性为83.64%，特异性为74.0%。 非血液标本的基因甲基化也可用于肺癌的诊断。国内学者[30]研究显示，痰液甲基化基因RASSF1A、3OST2联合检测miRNA（miR31、miR210），区分无肿瘤的吸烟者与Ⅰ期非小细胞肺癌的敏感性为87.3%，特异性为90.3%。国内学者[31]研究发现，支气管液的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（P16）、Ras相关结构域家族1亚型（RASSF1A）、大肠腺瘤性息肉病（APC）和矮小同源框2（SHOX2）基因的甲基化状态与肺癌显著相关。 基因甲基化具有早期出现、位点多等优点，其检出肿瘤的灵敏度超过了既往的标志物。2018年9月，在钟南山院士领导下，联合23家研究中心，启动全球首个大规模 “ctDNA甲基化高通量检测用于肺部结节良恶性诊断和监测的临床研究（NCT03651986）”，目前，项目已完成全部受试者入组工作，该研究将进一步证实ctDNA甲基化在早期肺癌中的诊断价值。初步研究显示，基于靶向DNA甲基化测序的诊断模型，表现出优异的综合诊断性能：在6~20mm大小的结节亚组（n=100）中，当发病率为10％时，该检测模型灵敏度为100.0%；在I期肺癌样本中（n=90），该检测模型灵敏度为97.1%；对于纯磨玻璃结节（n=67）, 该检测模型灵敏度为96.4%[32]。 缺点：目前尚未发现只存在于一种肿瘤的DNA甲基化，检测到DNA甲基化不能确定是肺癌还是其他恶性肿瘤。 3.5微小RNA 微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一种长度为18~25个核苷酸的单链非编码 RNA，广泛存在于真核生物，虽然不编码蛋白质，但其通过与靶基因完全或不完全互补，从而促进mRNA切割或者抑制mRNA翻译，调控转录后基因表达，是迄今为止人类发现的真核生物中携带核酸信号分子的最小信息载体[33]。1993年Victor R. Ambros团队在对秀丽杆线虫的研究中首次发现miRNA，随后迅速成为研究热点，到2020年底，在PubMed数据库中可以搜索出约11.2万篇以miRNA分子为主题的研究文章，2018年3月发布的miRbase生物目录最新版本(v22)中，已有2656个与人类相关的miRNA被鉴定出来[34]。众多研究表明，miRNA在各种生物过程中起着至关重要的作用，包括癌症、免疫、代谢和细胞发育等[35]。 预测肺癌：意大利学者[36]研究发现，在肺CT发现肺癌之前采集的15个样本中，miRNAs识别了12个肺癌样本，敏感性为80%，特异性为90%，即螺旋CT未提示影像学异常时，血浆miRNA早期诊断肺癌的灵敏度是80%，特异度是90%，在疾病发生前28个月，mir-660、mir-140-5p、mir 451、mir-28-3p、mir-30c和mir-92a是最常见的失调的miRNAs。 大量研究证实miRNA对肺癌有辅助诊断价值，痰、支气管肺泡灌洗液、血液等标本均可用于肺癌的诊断。Li等[37]行Meta分析，纳入6项研究，包括480例非小细胞肺癌患者和451例健康对照者，循环血液miR-25诊断中国人群非小细胞肺癌的汇总敏感性为75%、特异性为81%。Sun等[38]行Meta分析，纳入5项研究（439例患者和463例健康对照），miR-126诊断非小细胞肺癌的汇总敏感性为0.83（95%CI:0.59-0.94），特异性为0.83（95%CI:0.71-0.90）。2016年，Yang等[39]行Meta分析，9项研究纳入分析，涉及993名患者（554名肺癌患者和439名非癌症患者），microRNA-210诊断肺癌的敏感性为66%，特异性为82%。2018年，He等[40]行Meta分析显示，通过检测血清和痰液中miR-210的表达，对非小细胞肺癌具有显著的诊断能力（AUC分别为0.82和0.81）。2020年，Hu等[41]行Meta分析显示，miR-210鉴别肺癌和健康对照的敏感性为66%，特异性为79%，基于miR-210的联合生物标志物的诊断准确率高于单个miR-210，其敏感性为76%，特异性为88%。Shao等[42]行Meta分析显示，miR-155在肺癌诊断中的汇总敏感性和特异性分别为82%和78%。Li等[43]对12项研究进行荟萃分析，miR-1在肺鳞癌中显著下调，汇总敏感性为71%，特异性为88%。Zhang等[44]对14篇文献进行荟萃分析，涉及1009例患者和1006例对照组，痰miRNA诊断肺癌的汇总敏感性和特异性分别为75%和88%。Jiang等[45]对71项研究进行荟萃分析，MiRNA诊断非小细胞肺癌的汇总敏感性、特异性分别为85%、88%，多个miRNAs（AUC:0.96）比单个miRNAs（AUC:0.86）具有更高的诊断价值，同时，miR-21和miR-210的AUC均为0.91。Wang等[46]利用7个非小细胞肺癌研究数据集对miRNA谱进行Meta分析，共鉴定出11个关键miRNAs，其中2个显著上调（hsa-miR-21-5p和hsa-miR-233-3p），9个下调（hsa-miR-126-3p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-143-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-328-3pn和hsa-miR-451），这些靶基因作为非小细胞肺癌的生物标志物可能有助于非小细胞肺癌的诊断。 目前有大量的文献报道了miRNA对肺癌具有诊断价值，各个研究报道了不同的miRNA，目前报道的对肺癌具有潜在诊断价值的miRNA高达上百种[47]。 存在问题：目前，miRNA用于肺癌诊断的很多研究是以健康人为对照组的，但以健康人为对照组的研究结果难以直接用于临床。miRNA与癌症的发生发展密切相关，但也参与机体的免疫反应、新陈代谢代谢及细胞发育等各个方面，可在多种疾病之中存在异常表达，以健康人为对照组的研究结果很难具有鉴别诊断价值。诸多研究显示，miR-21可用于肺癌的诊断，但大量研究显示miR-21在乳腺癌、骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤及血液系统、消化系统肿瘤等另外12种肿瘤性疾病中也存在异常表达，在心血管系统、消化系统、神经系统、呼吸系统、泌尿系统疾病及代谢性疾病、感染性疾病、结缔组织病等16种非肿瘤性疾病中也存在异常表达[48]，特别是呼吸系统，miR-21在特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病以及支气管哮喘中均表现为高表达[49]。由此可见，若患者存在合并症，miR-21表达异常难以区分肿瘤性疾病与非肿瘤性疾病；若患者没有合并症，miR-21表达异常难以区分肺癌和其他系统肿瘤性疾病。以健康人为对照组得出的敏感性、特异性及参考值，难以用于临床，若要得出可靠的结论，则对照组必须是非肺癌患者。另外，检测方法没有标准化，难以在临床中推广。 3.6肿瘤自身抗体 肿瘤自身抗体具有独特的优越性:①在肺癌早期即可检测到；②敏感性高，虽有白蛋白和其他蛋白质的干扰，也可以在肿瘤发生早期被准确地检测到；③特异性高；④抗体可以稳定存在很多年[50]。 预测肺癌：国内有文献提到，在CT发现癌症之前5年，肿瘤自身抗体即可早期发现肿瘤。这篇文章的观点引自2008年英国诺丁汉大学乳腺外科分会的学者发表在《Thorax》的论文《Autoantibodies in lung cancer: possibilities for early detection and subsequent cure》，然而这篇文章不是研究这个问题的，这篇文章只是引用了其他文章的观点。查到全文，原来原始数据来自于《Journal Of Thoracic Oncology》（影响因子15）的一篇文章。2006年，美国学者对梅奥诊所CT筛查试验的102个样本（6个现患肺癌样本，40个是在CT诊断肺癌前1~5年提取的样本，56个风险匹配对照组样本）进行肿瘤自身抗体检测；对于6个现患肺癌样本，肿瘤自身抗体全部预测到肺癌；对于40个在CT诊断肺癌前1~5年提取的样本，肿瘤自身抗体预测到肺癌的有32例（80%），提示在CT发现肺癌之前5年，肿瘤自身抗体就可以早期发现肺癌[51]。 诊断肺癌：2008年英国学者[52]在《Thorax》发表研究，采用酶联免疫吸附法检测正常对照组（n=50）、非小细胞肺癌组（n=82）和小细胞肺癌组（n=22）血浆中p53、c-myc、HER2、NY-ESO-1、CAGE、MUC1和GBU4-5的自身抗体，结果示76%的肺癌患者和89%的淋巴结阴性患者血浆中至少有1/7抗原的自身抗体水平升高，诊断肺癌的特异性为92%。 单项抗体诊断肺癌的敏感性很低。Chapman等[53]研究显示，只有17％的小细胞肺癌患者HuD自身抗体与对照组相比具有较高水平。Türeci等[54]研究发现，只有20%的肺癌患者有NY-ESO-1自身抗体反应。 自身抗体联合检测可提高诊断的敏感性。Jett等[55]检测1613例美国人肺癌自身抗体谱（p53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、SOX2、MAGE A4 和 HUD），61例最终确诊肺癌（25例自身抗体谱检测为阳性），敏感性为41%。Chapman等[52]对104例肺癌患者和50名正常对照者检测7种抗体谱（c-myc、P53、HER-2、MUC1、NY-ESO-1、CAGE 和 GBU4-5），单项抗体检出阳性率为5%～36%，但是联合抗体谱检测的敏感性高达76%，特异性为92%。2017年国内进行一项多中心研究，检测7个肺癌抗体谱（p53、GAGE7、PGP9.5、CAGE、MAGEA1、SOX2 和 GBU4-5），验证组包括818例肺癌患者和1190名健康人或其他疾病患者，该组抗体谱诊断Ⅰ期和Ⅱ期非小细胞肺癌的敏感性可达到62%和59%，诊断局限性小细胞肺癌的敏感性为59%，联合低剂量CT可提高具有磨玻璃结节和实性结节特征的早期肺癌的检出率[56]。 检测技术对检测结果有影响。①酶联免疫吸附测定（ELISA）。此法临床应用最广泛，但每次只能检测一个分子。Rom 等[57]采用此法检测自身抗体谱（c-myc、Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、CDK2、Survivin），诊断肺癌的特异度为97%，敏感度为87%。②重组cDNA 表达克隆血清肿瘤抗原分析（SEREX）。Leidinger等[58]采用该技术鉴定出肺鳞癌的82种自身抗体，发现利用20个抗体的组合区分鳞癌与健康人的敏感度为92.9%，特异度93.1%；69个抗体时分别为75.2%、93.5%；80个抗体时为79.0%、99.2%。③噬菌体展示技术。Chen等[59]将噬菌体展示技术与蛋白芯片技术相结合，筛选出2304个多肽，由22个多肽组成的分型模型，诊断肺癌的敏感度为85%、特异度为86%。④血清蛋白组学分析（SERPA）。He等[60]采用该技术鉴定出多个非小细胞肺癌的自身抗体（如α-enolase、CEA和CYFRA21-1），然后采用ELISA检测自身抗体谱，诊断肺癌的敏感度为69.3%。 自身抗体诊断肺癌的局限性：①成本较高；②不是所有阳性抗体均能且只能诊断某一种疾病；③不是所有患者都能检测到相应的自身抗体，灵敏度欠佳；④准确度不理想，阳性结果只能辅助诊断肺癌，阴性结果却不能排除肺癌[61]。 3.7外泌体 外泌体广泛分布于血液、尿液、乳汁和唾液等各种体液中，是一种由细胞主动分泌的由膜包裹的大小均一、直径约为30nm-200nm的脂质双分子层结构小囊泡，其内容物包含不同类型的来源于其亲本细胞的蛋白质及核苷酸。 外泌体的蛋白标志物：很多外泌体的标志性膜蛋白可以作为肺癌的诊断标志物，如CD91、CD317、表皮生长因子受体（EGFR）等[62]。Niu等[63]对125例NSCLC患者和46名正常人进行研究，与健康对照组相比，NSCLC患者外泌体中AHSG和ECM1的表达水平显著升高，具有潜在的诊断价值。有研究发现[64]，外泌体中CD151、CD171、tetraspanin8在肺癌患者中的表达水平明显高于正常人，具有肺癌早期诊断的潜力。 外泌体的核酸标志物：大量的文献报道外泌体中的miRNAs可作为肺癌的诊断标志物。2006年Yanaihara等[65]通过全基因组测序发现NSCLC患者肺组织中有 12种特异性miRNAs，2009年Rabinowits等[66]研究证实NSCLC患者血浆外泌体miRNA谱与之一致。 国内有文章提到，Vanni等研究发现外泌体miR-25等对肺癌有潜在的诊断价值，但是作者引用的参考文献，其实是Vanni等[67]写的综述，文中列举了很多研究，提示外泌体中的miRNAs对肺癌具有潜在的诊断价值。Rodríguez等[68]研究发现，miR-122具有肿瘤特异性，并且与标本无关，即血浆和灌洗液miR-122都具有诊断价值。Cazzoli等[69]研究发现了6个血浆外泌体microRNA（miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100和miR-154-3p）有助于区分肺腺癌和肉芽肿。 存在的问题：外泌体的分类尚无世界范围内统一的标准；外泌体蛋白和miRNA作为诊断标志物的研究日益增多，但研究结果重叠的不多；当前传统的外泌体提取和分离技术还远远不能满足高灵敏度的要求；目前还没有建立一套统一的外泌体分离分析方法的标准。 3.8呼出气凝聚液分析 呼出气成分分析是利用气相色谱联合质谱分析检测肺癌细胞膜过氧化并释放的可挥发有机化合物（volatile organiccompounds, VOC），此法是肺癌筛查的理想方法之一，因为操作简单、价格便宜且为非侵入性、无放射性。 Oguma等[70]从116例经组织学证实的肺癌患者和37名健康志愿者（对照组）采集呼吸样本，肺癌患者呼出的环己烷和二甲苯浓度显著高于对照组，并随着癌症临床分期的进展而显著升高，治疗（放疗、化疗）后小细胞肺癌患者呼出气中的环己烷和二甲苯的浓度显著降低。Schumer 等[71]采用质谱法分析呼出气中的肿瘤特异性羟基化合物水平，纳入受试者415例，以1项以上指标升高为标准，诊断肺癌的敏感度为93.6%，特异度为85.6%。 存在的问题：检测方法没有规范，对肺癌诊断有价值的可挥发有机化合物的种类缺乏临床验证，检测技术的影响因素及影响情况不确定，此项技术目前尚不能用于肺癌筛查。 3.9血清蛋白质组学 蛋白质组学技术在近些年不断提高，研究发现许多与肺癌相关的血清蛋白生物标志物，包括血清淀粉样蛋白A、血浆激肽释放酶、结合珠蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白、过氧化物酶 1、补体成分C9和C4d、孕酮受体膜组分1、基质金属肽酶1和核基质蛋白[72]，但这些标志物均处于实验室检验阶段，临床价值还有待更多的研究证实。 3.10代谢组学技术 基因组学是从分子生物学水平找出与疾病可能相关的基因。蛋白质组学则是从蛋白质水平找出与正常生理状态下相比表达有差异的蛋白质。代谢组学的研究对象是内源性代谢物质，通过定性和定量分析肿瘤的所有代谢产物，可以多角度地寻找肺癌的标志物，主要的技术包括核磁共振技术（nuclear magnetic resonance，NMR）、液相色谱-质谱法技术liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS等。 Miyamots 等[73]用气相色谱-飞行质谱技术分析肺癌患者的血液样本，发现色氨酸、组氨酸和赖氨酸的浓度在非小细胞肺癌患者中明显降低，甘油、乙醇胺、麦芽糖、棕榈酸、谷氨酸和乳酸的浓度明显升高。Musharraf等[74]采用液相色谱-质谱法技术技术对肺癌、COPD、健康吸烟者和不吸烟者进行研究，发现肺癌患者血浆中脂肪酸、酸和葡萄糖的水平较其他组均升高。Carrola 等[75]采用核磁共振氢谱技术对肺癌及健康人尿液进行了代谢组学分析，发现肌酐、ɑ-羟基异丁酸等含量显著升高，而葫芦巴碱、马尿酸盐的含量显著降低。 目前代谢组学对肺癌发生发展的机制、代谢特征等认识均不够全面，在许多方面还不成熟,基本处于试验阶段。 3.11肿瘤化血小板（Tumor educated platelets，TEP） 2015年Best提出了TEP的概念，肿瘤相关分子在与肿瘤细胞对抗的过程中转移至血小板内，最终形成TEPs，血小板表面受体被激活会发生特异性的前体mRNA剪接，从而产生独特的mRNA表达谱，对肺癌具有潜在的诊断价值。 Best等[76]对228例肿瘤患者进行研究，包括肺癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、结直肠癌、肝胆癌及乳腺癌，健康对照55例，对283例样本的血小板mRNA表达谱进行检测，发现TEP中有20种非蛋白质编码RNA表达异常，诊断非小细胞肺癌的准确率高达79%。 缺点：目前相关研究太少，依据不足。 小结 目前早期肺癌的诊断标记物如雨后春笋般大量涌出，有前景的标记物很多，但是检测技术有待改进，临床价值有待更多的研究证实。 参考文献： 1. 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