荧光探针与荧光引物要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(fluorescenceresonanc
eenergytransfer,FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体(donor)和能量受体(accep
tor)对,其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1—10nm)时，激发供体而产生的荧光
能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的
重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。?一：水解探针法?TaqMan技术原理：除了一对特异性引物，
TaqMan探针法增加一条和模版互补的基因特异性探针（通常20—30bp），探针上5''端和3''端分别标记了一个报告荧光基团（供体）
和一个淬灭荧光基团（受体），在反应初始（探针完整）时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号
；而当PCR过程中TaqDNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5''-3''核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针5''端的报
告基团——游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。这样每扩增一条DNA链
，就对应有一个游离的荧光分子（报告基团）形成，保证了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此对荧光信号进行检测就可以实时监控P
CR的过程，准确定量PCR的起始拷贝数。但是实际上探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生不同波长
的荧光，都会使得本底偏高.MGB技术?原理：针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqM
an探针——MGB探针（minorgroovebinderoligodeoxynucleotideconjugate,MGB
-ODN)，3''端采用了非荧光性的淬灭基因——淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3
''端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide,DPI3)，可以大
大稳定探针与模板的杂交,升高探针Tm值,使较短的探针同样能达到较高的Tm值——而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近,
淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高：一个15bp的MGB探针的信噪比大于6,优于理想状态下的25bp的普通Taqman探针
（信噪比约为1.5）。允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。有实验证明MGB探针对于等位基因的区分比较理想，甚至可以检测单碱
基突变(因为碱基错配对较短探针的杂交稳定性影响更大)水解探针之所以称之为水解，主要是因为它利用的是Taq酶的水解作用，使得探针上的
荧光报告基团远离淬灭基团而发光信号，游离的报告基团数目对应PCR新扩增产物，此方法检测的是积累荧光。?优点：?灵敏，特异性高：具有
模版序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步提高的定量PCR的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检
测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针
法可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响??缺点：探针设计有一定难度，需要
验证效果，探针的合成和双荧光标记成本高.二：杂交探针法FRET技术?原理：罗氏专利的FRET探针又称为双杂交探针，或者LightC
ycle探针。FRET探针由两条和模版互补、且相邻的特异探针组成（距离1—5bp），上游探针的3`端标记供体荧光基团，相邻下游探针
的5`端标记Red640受体荧光基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Red640受体基团紧密相邻（距离1—5bp）
，激发供体产生的荧光能量被Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到Red640发出波长为640的荧光。当变性时，两探针游离，两
基团距离远，不能检测到640波长的荧光。FRET探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，非累积信号，
可以用于做Tm曲线和SNP检测。常用的受体荧光基团除了LC-Red640还有LC-Red705。两个单标记探针的长短不影响信号的传
递，而探针间的距离通常为1-5bp（虽然越短越好，还是要留点空间避免相互之间的反应）。我们前面提到，Taqman水解探针法中，一但
报告基团水解离开淬灭基团，就一直游离于反应体系中可被检测，所以检测的是累积荧光，是不可逆的。杂交探针不同，是复性时两条特异探针杂交
到模板上，相互靠近而产生检测信号，到升温变性探针远离模版就没有信号，所以检测的是实时信号，是可逆的，所以可以进行熔解曲线的分析，还
可以用于进行突变分析，SNP基因分型以及产物鉴别。比如一旦探针位置上出现有点突变，通过熔解曲线就可以很快分析出来，这也是Taqma
n法无法做到的。另外，由于采用2条模版特异的探针，杂交探针法的专一性无疑更高于其他方法，不受非特异产物的影响。Fret探针法由于
需要合成2条探针，探针的末端要封闭以避免反应，所以合成的成本会比较高，也比较麻烦。但实际上，Fret探针的设计其实比Taqman探
针容易，因为Taqman探针要求一定的长度以保证探针的特异性和结合模版的能力，但是长度会导致两末端的荧光基团距离远而使得荧光共振能
量传递的效率降低，淬灭不彻底。Fret探针就不受这个限制。不管怎么说，多数人还是习惯认为单探针比合成2条探针要简单。在水解和杂交探
针技术之间产生另外一种技术：分子信标（分子信标产生时间是1996年）.第三代：荧光引物?Amplifluor技术?原理：激发的荧光
进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭。目标特异性Amplifluor引物包含一个5’内部互补序列，标记有荧光发色团（flu
orescerin）和一个能量受体：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。发夹结构的3’端序列是目标特异性引物区。未结合的Am
plifluor引物由于内部荧光发色团和淬灭分子的紧密接近，只有低的荧光信号。在第一个循环中，Amplifluor引物1与特异CD
NA的第一条链退火并被Taq酶延伸。在第二个循环中Amplifluor引物1延伸产物作为引物2（反义链引物）的模板。一旦引物2被
Taq酶延伸，Amplifluor发夹引物解折叠并产生荧光信号。随后的扩增循环中产生的荧光信号的增强与扩增产物量的增加成比例。LU
X技术原理：LUM(lightuponextention)引物技术是Invitrogen公司的一项专利，是利用荧光标记的引物实
现定量的一项新技术。使用类似分子信标的发夹结构设计引物，使引物同时起到荧光探针的作用。引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。
在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。
使用LUX引物，不需要专门设计探针，即省了成本又给实验设计提供了宽松的条件。由于没有探针控制特异性，因此他的特异性要弱于探针技术，但非特异性扩增或引物二聚体没有影响，所以其特异性要强于SYBRGREEN。SYBRGREENFRET探针Taqman分子信标LUX引物性质可逆荧光积累荧光熔点分析能不能特异性引物（非特异性扩增或引物二聚体有影响）引物＋2探针引物＋探针引物＋探针引物（非特异性扩增或引物二聚体无影响）探针不需要通用性 |
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