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讲堂精粹 | Annexin V凋亡检测实验详解

2021-08-11  井里的怪兽

细胞凋亡(Apoptosis)又称细胞程序性死亡(Programmed cell death),是一种为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的主动的死亡。凋亡的紊乱与肿瘤、自身免疫性疾病的发生具有直接或间接的关系,在细胞领域具有重要的研究价值。

细胞凋亡是个复杂的过程,不同的凋亡时期具有不同的检测方法。

其中磷脂酰丝氨酸(PS)外翻分析(Annexin V)是检测细胞早期凋亡最常见的方法。原理很简单,即细胞发生凋亡时,位于细胞膜内的PS外翻到细胞膜表面,暴露于细胞外环境中。和偶联荧光染料的Annexin V特异性结合,同时加上核酸染料(它只能穿透死细胞膜)如PI,这样便可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

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接下来,小柏为您讲解下Annexin V检测凋亡的详细实验步骤。

01

细胞处理和染色

细胞处理是凋亡实验中很重要的步骤,必须在单细胞悬液的状态下进行后续的染色。

对于贴壁细胞,用不含EDTA的胰酶进行消化(注:对于比较难消化的细胞,也可以用含低浓度EDTA的胰酶消化,最后细胞多洗几遍,减小EDTA鳌合钙离子产生的影响),收集细胞悬液进行计数;悬浮细胞可直接计数;对于组织样本,需要将其消化成单细胞悬液才可以进行后续实验。具体实验流程如下:

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这里要特别提醒一下大家——

贴壁细胞进行消化的时候,消化时间过长会造成细胞膜的损伤,导致Annexin V假阳性;PI具有细胞毒性,染色时间也不易过长,尽量在一小时内上机。

02

实验设计

流式的对照一直很令人头疼,空白管、阴性管、单阳管、阳性管都是啥意思?它们的目的是什么?每一次实验都需要做吗?别急,今天小柏来为你们解惑。

细胞用流式仪器检测时,需要在一个合适的实验模板里进行信号的收集,即模板里包含所有染色抗体对应的荧光通道,而且包括散射光和荧光通道在内的各个通道的电压要合适(信号既可以被清晰地看到,又不会跑到视野外)。

因此,在第一次做凋亡实验时,需要用空白对照和单阳管调节电压和补偿,建立一个新的合适的实验模板,后续的实验(相同的仪器、同一批细胞系、同样的染色方案条件)可以不必再重新设置电压和补偿。阴性管和阳性管在实验条件稳定、细胞分群明显的情况下,也可以不必再使用。

具体的实验设计方案如下:

  • 空白管:未经任何处理的阴性对照组细胞,不加Annexin V和PI。用于调节电压

  • 单染管:经过处理的发生凋亡的细胞,分别加Annexin V和PI。用于调节补偿。

  • 阴性管:未经任何处理的细胞,加Annexin V和PI。目的是排除细胞自身凋亡以及实验操作过程带来的凋亡和坏死。用于确定正常细胞状态,排除假阳性

  • 阳性管:经过处理的确定发生凋亡的细胞,加Annexin V和PI。用于确认试剂、仪器、操作没有问题。

  • 检测管:处理的细胞,加 Annexin V和PI。用空白管和单染管调节好电压和补偿后,获得所需要的流式数据。

03

数据分析

流式数据的分析是获得结果的最后一步,一定要重视,否则实验就前功尽弃了。我们应该如何操作,才能得到漂亮准确的流式图呢?

简单总结,就是调节补偿、设门和结果统计。


PART  ONE


  • 调节补偿

补偿的调节是因为荧光通道之间存在光谱重叠的现象,需要把目的通道里任何其他的干扰信号去掉。

前面提到用单阳管来调节补偿,在流式细胞仪上可以手动调节,也可以自动调节。当然,也可以采集完所有数据之后,用FlowJo V10软件调节,不过小柏还是最喜欢在仪器上调节补偿,因为调节好补偿收集数据时,我立马就可以知道这次的实验结果好不好了。


PART  TWO


  • 设门

补偿调节后,接下来就是设门了。

首先,在FSC和SSC图上圈出目的细胞群,注意不要圈到碎片;其次,在Annexin V和PI荧光通道画十字门,以对照组细胞同时加了Annexin V和PI的阴性对照组来界定门的位置,结合数据的实际情况进行微调。同一批实验,最好用统一的十字门。其实Annexin V凋亡实验,通常情况下细胞分群还是挺好的,比较容易设门。

下面流式图是用四正柏的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测的一个凋亡样本。

我们通过十字门,将细胞分为了四个象限,分别对应了四种不同的染色情况。左下象限是健康的活细胞,用Annexin V-/PI-表示,右下象限是早期凋亡的细胞,用Annexin V+PI-表示,右上象限为晚期凋亡的细胞,但实际情况中,也包括了一部分坏死细胞,但是比例较少,用Annexin V+PI+表示,左上象限是非程序化死亡的细胞(不经凋亡,没有PS外翻,但是细胞存在机械性坏死,导致核酸染料进入),用Annexin V-PI+表示。

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小柏在这里再跟大家强调一下:主细胞圈门的时候,一定要排除掉细胞碎片。同时,有的细胞诱导凋亡后皱缩明显,侧群也会存在凋亡的信号,如下图所示,这样的信号也要圈进来,避免凋亡信号丢失而影响后续的结果分析。

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PART  THREE


  • 结果统计

凋亡实验中主要分析早凋的细胞比例,不过具体也要看实验目的,做三个重复之后,便可以统计数据了。

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最后,小柏给大家补充说明一些凋亡实验中经常遇到的问题。

01

我的细胞转染了带GFP的质粒,哪个试剂盒比较适合我?如何进行实验设计?

推荐用Annexin V Alexa Fluor647/PI凋亡检测试剂盒,不仅避开了FITC通道,而且Alexa Fluor 647和PE通道减少了调节补偿这个步骤。

实验设计如下:

1. 空白细胞,不带转染GFP的质粒,用于调节电压。

2. 转染GFP的空质粒对照组,不加Annexin V和PI,用于调节补偿。

3. 转染带有一段基因的GFP质粒,不加Annexin V和PI,用于设门对照。

4. 转染带有一段基因的GFP质粒,加Annexin v和PI,即实验组。

02

细菌和藻类可以用Annexin V试剂盒检测凋亡吗?

都可以的。用植物检测凋亡时要先用果胶酶去除细胞壁。

03

Annexin V方法检测凋亡适合所有的细胞吗?

某些细胞的细胞膜外表面带有大量的PS,因此不能使用该方法(比如巨核细胞、血小板、某些骨髓系细胞)。

04

细胞上清需要收集吗?

需要收集,因为上清也会有一些凋亡的细胞。最后与消化的单细胞悬液混合,进行染色。

05

Annexin V-PI+象限属于什么细胞?

一般认为是机械性坏死细胞。对于悬浮细胞,多数都是细胞膜丢失得差不多了;而对于组织细胞或贴壁细胞,则多为消化、刮擦等导致的膜损伤。Annexin V-PI+细胞因过度消化、高速离心、大力吹打,而使膜受损。受损只是通透性增强,PS并没外翻。所以,小分子的PI进入,蛋白大分子的Annexin V被挡在外面。一般Annexin V-PI+细胞比例建议控制在5%以内。

06

MTT法在酶标仪上检测时,有明显的药物浓度趋势,但用流式检测时,却看不到这样的趋势,这是什么原因?

MTT和Annexin V检测原理不同,它主要是用于测细胞活力,反映细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶的活性,并不完全代表细胞的凋亡、周期阻滞或坏死。一些死细胞、碎片会造成OD值增高,产生假阳性结果。最好以流式检测为准,两种方法检测趋势一致时,实验结果更易被信服。

07

凋亡结果怎样可以接受?

一般情况下,正常细胞的早期凋亡率约5%左右,经凋亡诱导的细胞的早期凋亡率明显上升,有的20-30%,有的30-40%,不同类型的细胞有差异;即使同种细胞,前后两次实验的细胞状态不一致时,凋亡率也会不一致,通常三次实验后做统计学分析。

08

如果细胞带有RFP荧光或者用阿奇霉素处理过,该选用什么试剂盒?

避免使用PI通道的试剂盒。推荐用Annexin V-FITC/7-AAD凋亡检测试剂盒(FXP145)Annexin V-Alexa Fluor 488/7-AAD 凋亡检测试剂盒(FXP146)

09

血液样本检测凋亡该如何处理?

务必去除血液中的血小板,因为血小板含有PS,容易与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲液200g离心去除血小板。

10

如何同时进行Annexin V凋亡染色和表面染色?

建议Annexin V和表面染色分开进行。表面染色后,在PBS里洗细胞,离心,然后在Binding Buffer(含钙离子)里进行Annexin V染色。



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今天有关Annexin V凋亡实验的内容就结束了,如果大家有问题,欢迎随时咨询小柏,或者直接联系您身边的四正柏人,我们将竭力为您提供最优质的产品和服务。

科研路上,我们一直在陪伴您!

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Annexin V检测凋亡产品线:

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