AAV基因疗法开发的进展与挑战丨医麦猛爆料

2021年9月4日/医麦客新闻 eMedClub News/--腺相关病毒（AAV）载体是基因治疗领域最常使用的病毒载体之一，可将健康的基因拷贝运送到患者的细胞中，其应用潜力已经得到了大量的验证。

作为递送基因疗法的有力工具，AAV具有许多吸引人的特征，包括无致病性、高效的长期基因表达、易于基因操作以及免疫反应低等特点，令人满意的一系列特性是其作为基因递送工具的重要原因。

近年来，两款AAV基因疗法获批上市，包括治疗眼部疾病的Luxturna和靶向中枢神经系统的Zolgensma，进一步推动AAV成为了业界关注的焦点，持续升温。

▲ Luxturna（左）和Zolgensma（右）

目前，国内外AAV基因疗法的临床试验达200多项，在多种适应症上取得了进展，包括罕见眼科疾病、先天性耳聋、β地中海贫血症、血友病、杜氏肌营养不良、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、溶酶体贮积症等。

国内近期也迎来了两款AAV体内基因治疗的监管动态：

• 2021年3月，纽福斯宣布AAV基因治疗NR082获得国家药品监督管理局（NMPA）颁发的注册性药物临床试验（IND）许可，用于Leber遗传性视神经病变。NR082是国内首个获得临床试验许可的眼科体内基因治疗药物。

• 2021年8月，信致医药（信念医药全资子公司）自主研发的BBM-H901注射液，一种用于预防血友病B成年男性患者出血的AAV基因治疗药物，获得NMPA的IND批准。这是国内第一个获批进入注册临床试验的血友病AAV基因治疗药物，也是国内第一个全身给药的罕见病基因疗法。

然而，制造出一种安全有效的AAV疗法并不容易。其生产过程具有复杂性，开发人员首先生产包含所需DNA序列的AAV，利用细胞培养构建载体，然后经过提取和纯化病毒颗粒。

另外，与AAV开发相关的质量问题也可能来自方方面面。首先，AAV载体培养过程通常无法产生足够的病毒滴度。其次，提取到的病毒颗粒可能含有残留的宿主细胞成分，例如蛋白质、核酸、细菌和其他病毒，以及来自血清和动物的细胞培养基中的蛋白质。最后，一些AAV衣壳可能不包含预期的序列，即它们可能是空的，或者包含错误包装的宿主细胞DNA。

所有这些挑战都会给患者带来很大风险，但是有一个共同点，就是需要严格的质量控制。因此，确保所有AAV批次达到适当的病毒滴度，并且不含有害杂质和污染物，是十分关键的。

➤ 病毒滴度

只有当达到足够的病毒滴度，AAV基因治疗才能够有效地发挥作用。然而，传统上游工艺产生的病毒滴度，往往低于治疗患者所需。为了达到有效剂量，批次需要浓缩100到10,000倍。

然而，许多已有的浓缩装置并不是针对AAV设计的，无法将AAV病毒浓缩到如此小的体积。此外，该过程还增加了批次中宿主细胞污染物的浓度，为污染物的检测和去除增加了难度。

➤ 空衣壳

空衣壳不具备治疗效果，是可能影响AAV基因治疗有效性的主要杂质。这些衣壳还会与完整衣壳竞争结合受体，空壳率高则使得达到治疗效果需要加大剂量，但这可能会增加副作用，特别对于靶向大脑、脊髓等体积较小的组织，将更具有挑战性。

另外，空衣壳会带来不必要的免疫原性风险。虽然AAV被认为是一种免疫原性低的递送载体，并且AAV衣壳中不含工程化脂质体或其他化合物。但衣壳蛋白本身可以引发先天免疫反应，阻碍病毒感染人体细胞并降低治疗效果。

▲ rAAV生产过程中产生的主要衣壳类型（图片来源：Molecular Therapy）

总的来说，AAV在生产工艺上，对载体生产的纯度有很高要求。空衣壳不仅增加了AAV基因治疗的所需剂量，还会导致不必要的副作用，并引起针对病毒的不必要的免疫反应。因此，空壳病毒作为杂质需要采用经过验证的方法，进行有效检测并最大限度地去除，同时明确含量的测定。

AAV空壳率的检测一直是难点，分析型超速离心技术（AUC）依据空壳病毒与全病毒颗粒沉降系数的不同，可以精确测定产物种AAV病毒载体的空壳率，同时可以检测中间产物、病毒载体碎片、基因组碎片、病毒聚集体等。AUC是业内公认的AAV空壳率检测 “金标准”。

毛细管电泳（CE）具有分辨率高、操作自动化、样品量小等优点，近年来已成为生物样品分析中最先进的分析方法之一，也已经应用于了制药企业的药物申报和质控。CE是一类以毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力，依据样品组分之间电泳淌度和分配行为的差异而实现分离的新型液相分离技术。

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