超级干货！分子诊断技术全解析！（建议收藏）

来源： 云起IVD   作者：阁主Pro

分子诊断技术是用分子生物学方法针对人体及各种病原体的遗传物质的表达及结构进行检测，从而达到预测及诊断疾病的目的。

近年来，随着分子诊断技术的升级迭代，分子诊断的临床应用越来越广泛和深入，分子诊断市场进入快速发展期。

笔者总结市场上常见的分子诊断技术，分为上中下三篇，上篇介绍PCR技术，中篇介绍核酸等温扩增技术，下篇介绍测序技术。今天为大家带来上篇PCR技术。

PCR技术

PCR (polymerase chain reaction)聚合酶链式反应，是体外DNA扩增技术之一，至今已经超过30年的历史。

PCR技术于1983年由美国Cetus公司的KaryMullis首创，1985 年Mullis申请了PCR专利，同年在Science上发表了第一篇PCR 学术论文，1993 年Mullis因此获得了诺贝尔化学奖。

PCR基本原理

PCR可以将目标DNA片段扩增一百万倍以上，其原理是在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

标准 PCR 过程分为三步：

1.变性（Denaturation）：利用高温使DNA 双链分离。DNA双链之间的氢键在高温下（93- 98℃）被打断。

2.退火（Annealing）：在 DNA 双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA 上。

3.延伸（Extension）：DNA 聚合酶由降温时结合上的引物处开始沿着DNA 链合成互补链，延伸完成，则完成一轮循环，DNA片段数增加一倍。

往复循环这三个步骤25-35 次，DNA 片段数将得到指数级增加。

PCR的巧妙之处在于针对不同的目标基因可以设计不同的引物，使目标基因片段在短时间内得到百万级的放大。

目前为止，PCR可以分为三类，分别是普通PCR、荧光定量PCR和数字PCR。

第一代普通PCR

采用普通PCR 扩增仪来对靶基因进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，只能做定性分析。

第一代PCR主要缺点：

• 容易发生非特异性扩增和假阳性结果。

• 检测耗时长，操作繁琐。

• 只能做定性检测。

第二代荧光定量PCR

荧光定量PCR（Real-Time PCR），也叫做qPCR，通过在反应体系中加入能够指示反映进程的荧光探针，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累，通过荧光曲线来判断结果，并可以借助Cq 值和标准曲线来定量。

 

qPCR 技术由于操作过程在封闭体系中进行，降低了污染概率，并且可以通过对荧光信号监测从而进行定量检测，因此临床应用最为广泛，已成为PCR中的主导技术。

实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为：TaqMan荧光探针、分子信标和荧光染料。

 

1)TaqMan荧光探针：

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

 

2)SYBR荧光染料：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

3)分子信标

是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。

PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。

 

第二代PCR主要缺点：

• 灵敏度还有欠缺，低拷贝标本检测不准确。

• 存在背景值影响，结果易受干扰。

• 当反应体系中有PCR抑制物时，检测结果易受干扰。

 

第三代数字PCR

数字PCR（DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR）通过终点检测计算目标序列的拷贝数，无需采用内参和标准曲线即可进行精确的绝对定量检测。

数字PCR采用终点检测，不依赖于Ct值（循环阈值），所以数字PCR反应受扩增效率的影响降低，对PCR反应抑制物的耐受能力提高，具有很高的准确度和重现性。

由于具备高灵敏度、高精确度的特点，不易被PCR反应抑制剂干扰，无需标准品可实现真正意义的绝对定量，而成为研究和应用热点。

根据反应单元的不同形式，主要可分为微流体式、芯片式和微滴式三大类系统。

1)微流体数字PCR，Microfluidic digital PCR，mdPCR。

基于微流控技术，对DNA模板进行分液，微流控技术能实现样品纳升级或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再与PCR反应体系结合，mdPCR已逐渐被其他方式取代。

2)微滴数字PCR，Droplet-based digital PCR，ddPCR。

利用油包水微滴生成技术对样品进行微滴化处理，将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。

以伯乐的ddPCR为例，主要包括三个步骤：

    第一，准备样本和生成微滴，如下图，8x3的微孔板，一排加样本，一排加油滴，通过微滴生成器每个样本生成20000个微滴。

    第二，进行“油包水”PCR，把微孔板放入PCR扩增仪，对每个微滴进行40个热循环的PCR反应。

    第三，读取微滴结果，把微孔板放入读取仪，通过流式细胞技术获取每个微滴PCR终点结果的荧光信号，并用泊松分布原理纠正结果。

Bio-rad去年上市的Bio-Rad QX ONE数字PCR系统整合了微滴生成、热循环反应及微滴读取等步骤，最大程度减少人工操作。

配备四个独立的荧光检测通道，结合ddPCR特有的高阶多重PCR技术，可以在单反应孔中实现8重拷贝数变异(CNV)检测、5重突变检测或4重基因表达检测。

 

3)芯片数字PCR，Chip-baseddigital PCR，cdPCR。

利用集成流体通路技术在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动，将样本液体分成大小一致的纳升级于反应孔种进行数字PCR反应，实现绝对定量。

以法国Stilla technologies 公司的cdPCR技术为例，主要包括以下步骤：

 

    第一，加样和生成微滴：将样本和PCR反应液加入微流控芯片，放入仪器中，仪器可通过物理方法生成单层平铺的20000~30000个微滴阵列。

    第二，对每个微滴进行PCR扩增：在Naica Geode微滴生成扩增系统自动进行PCR扩增。

    第三，读取和分析结果：将芯片置于Prism微滴读取分析系统上进行荧光信号采集，计数阴阳性微滴，通过泊松分布计算获得靶标基因绝对拷贝数浓度。

 

总结一下，将样本和PCR反应液加入微流控芯片，放入仪器中，通过物理方法生成单层平铺的微滴阵列，随后对每个微滴进行扩增，然后进行六通道荧光信号采集，计数阴阳性微滴，通过泊松分布计算获得靶标基因绝对拷贝数浓度。

第三代PCR主要缺点：

• 仪器和试剂昂贵。

• 模板质量要求较高，模板量超过微体系量将导致无法定量，过少则定量准确度降低。

• 当存在非特异性扩增时也会产生假阳性。

PCR的各种延伸技术

1.递减PCR（touchdown PCR）：前几循环温度逐渐下降。

2.逆转录PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆转录而来的cDNA 为模板，也因为是从表现型基因来进行增量的，由此产生出来的cDNA 产物不带有内含子（基因中不具意义的段落），常应用于分子克隆技术。

3.热启动PCR（hotstart PCR）：以高热激活型核酸聚合酶进行反应，减少非专一性产物。

4.巢式PCR（nested PCR）：先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量，再用高特异性引物扩增。

5.多重PCR（multiplex PCR）：在同一个管中使用多组引物。

6.复原条件PCR（reconditioning PCR）：PCR 产物稀释 10 倍后重新放入原浓度的引物和dNTP 等循环 3 次，以消除产物中的异二聚体。

7.dsRNA 合成（dsRNA replicator）：合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶与Phi6 RNA replicase；从双股 DNA转录为对应的双股RNA（dsRNA）。可应用于RNAi实验操作。

8.COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature PCR):用以检测突变或特殊等位基因的PCR 应用技术。

参考文献：

1.刘婉彤等，分子诊断技术的临床应用进展

2.杨柳等，非鳞非小细胞肺癌基因检测技术研究进展

3.G.Terrance Walker,etc.Strand displacement amplification-an isothermal, in vitro DNA amplification technique

3.各公司官网