【原】PD转基因小鼠模型：帕金森疾病动物模型的研究进展

生物学渣 2021-09-14

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帕金森疾病(Parkinson’s disease, PD)是一种神经退行性疾病,现多认为是遗传和环境因素相互作用的结果。典型特征是黑质纹状体中多巴胺神经元丧失以及多巴胺缺乏相关的典型帕金森运动特征。动物模型在阐明PD 的发病机制，测试新的治疗方案及药物的研究中,具有十分重要的作用。啮齿类动物、树鼩和灵长类动物等采用不同造模方法所建立的PD 动物模型都拥有自己的优势和局限性,所表现出的临床特征和病理机制与人类有所不同。因此,在科学研究中选择所需使用的模型时必须仔细考虑。中国医学科学院、北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心,云南省重大传染病疫苗研发重点实验室张志成等撰文就主要神经毒素及转基因PD 动物模型的相关研究进展进行综述。

ＰＤ的动物模型大体上，可以分为三类：基于靶向儿茶酚胺能神经元的神经毒素损伤模型、基于ＰＤ相关基因的转基因模型以及二者的组合。目前每个模型都是模拟ＰＤ的一个或几个病理过程，每种模型都有自己的优点和局限，都不能完全模拟ＰＤ病理特点和疾病症状，可以根据实验目的选择合适的实验方案。

以下介绍PD转基因小鼠模型。

转基因模型主要是基于家族性ＰＤ相关基因的发现，迄今为止，已经鉴定了１５个致病基因和超过２５个遗传风险因子，归类为“ＰＡＲＫ”基因和“非ＰＡＲＫ”基因。已经证明α⁃synuclein 水平过表达，在病理发展中至关重要。

1、 基因敲除模型

Ｎｕｙｔｅｍａｎｓ等研究发现PINK1（PTEN induced putative kinase 1，PARK6）的约３０种致病突变与ＰＤ相关。然而，小鼠PINK1缺失不会导致明显的表型，迄今为止，开发的PINK1敲除和敲低小鼠模型显示轻度的神经退行性变化。Ｏｌｉｖｅｒａｓ⁃Ｓａｌｖá等研究显示重组腺相关病毒（ｒAAV）２／７载体介导的雌性C57BL/6 小鼠ＳＮ中PINK1的敲低不会引起行为缺陷或ＤＡ细胞死亡、不增强α⁃synuclein诱导的神经病理学变化，但是在PINK1^-/-小鼠中α⁃synuclein 诱导的ＤＡ能细胞死亡和磷酸化增强。PINK1^-/-小鼠ＳＮ中的ＤＡ神经元没有丧失，但纹状体中突触可塑性受损，表型仅显示总ＤＡ水平的轻微降低。而Ｇｌａｓｌ等在PINK1^-/-C57BL/6Ｊ小鼠中观察到ＤＡ细胞的丧失、神经变性增加，表现为ＰＤ早期症状。

钙离子非依赖型磷酸酯酶A2，VIa亚型（Ca2+-IndependentPhospholipaseA2,Group VIa , iPLA2β）基因突变PLA2G6发生于ＰＤ的多种神经疾病中。Ｂｌａｎｃｈａｒｄ等研究显示，雄性iPLA2β-/-小鼠４个月时，神经病理学变化很小。１２个月时，小鼠出现运动障碍、小脑神经元损失和纹状体中α⁃synuclein 积累。１５～２０个月，该模型仍未出现ＰＤ特有的运动特征，仅显示神经炎症和ＰＤ相关的神经病理学变化。

Ｗａｎｇ等发现tetranectin基因敲除C57BL6/J小鼠（TN^-/-）与年龄匹配的ＷＴ小鼠相比，１２个月时，ＳＮｃ中ＤＡ神经元数量减少。ＤＡＴ、二羟苯乙酸水平升高，意味着小鼠纹状体ＤＡ能终端的代偿性增加。小鼠运动迟缓、旋转速度变慢，运动功能逐渐恶化，伴有中度至重度肢体僵硬和异常姿势，并且无自发行为恢复。两种基因型老年小鼠（＞１８个月）的ＳＮ中α⁃synuclein 免疫反应性均增加，但TN^-/-小鼠反应更明显，形成ＬＢ样物质。老年TN^-/-小鼠的纹状体α⁃synuclein 水平显著降低。该模型可能是研究ＬＢ形成、检测ＰＤ神经保护疗法或其他突触核蛋白病的有价值的模型。

PARK2基因（parkin基因）异常多导致青少年ＰＤ综合征。虽然parkin-/-和ＷＴ C57BL/6Ｊ小鼠在行为测试中没有差异，parkin 缺乏不会引起大量的ＳＮ变性或ＰＤ症状，但是parkin-/-诱发ＤＡ的半衰期延长，影响纹状体的ＤＡ释放。幼年parkin-/-小鼠中α⁃synuclein 释放和摄取减少表明ＤＡ神经传递早期症状的改变，而在老年parkin-/-小鼠的α⁃synuclein 增强可能反映ＰＤ晚期症状前期ＤＡ功能的补偿性适应。parkin 的遗传缺陷可能导致ＤＡ神经元的早发性生理功能障碍。转基因小鼠可以在一定程度上模拟与ＰＤ类似的一些神经病理学和行为表型。然而，与ＰＤ相关大脑区域（如ＳＮｃ或者蓝斑）的神经元损失，大多数转基因小鼠不会出现，并且病理学和表型的出现通常和细胞死亡一致，迄今为止的基因敲除小鼠都没有代表ＰＤ的真实模型。

２、病毒载体转基因模型

到目前为止，大多数基因敲除小鼠未能显示出明显的ＤＡ能细胞损失和ＤＡ依赖性行为缺陷。而通过向脑中靶向输入病毒载体，局部过表达α⁃synuclein，可以克服这一障碍。人α⁃synuclein 由第４号染色体SNCA基因编码。SNCA基因突变（包括A30P，E46K，G51D和A53T）以及SNCA倍增的特异性突变都与α⁃synuclein 聚集增加相关联，α⁃synuclein 模型有助于阐明与ＰＤ相关的基因对ＤＡ神经元变性的贡献。

Ｎｉｕ等通过慢病毒（LV）载体在恒河猴卵母细胞中表达A53T α⁃synuclein，７５个胚胎成功孕育出６只转基因猴。虽然转基因猴未出现明显的ＤＡ神经元退化及运动症状，但出现了年龄依赖性的、啮齿动物模型中难以模拟的ＰＤ非运动性症状—认知缺陷和焦虑。这与ＰＤ患者早期疾病阶段非运动性症状一致。该模型对研究人员认识ＰＤ早期病理事件和验ＰＤ的治疗靶点是有价值的。Ｅｓｌａｍｂｏｌｉ等使用ｒAAV２／５载体在绒猴腹侧中脑中表达ＷＴ、A53T α⁃synuclein。９周后出现运动症状，１５周ＷＴ组运动偏倚明显，３３周后A53T组运动性能逐渐恶化，运动协调错误增加。两组动物纹状体中Ｄ能纤维显著退化，在腹侧中脑区域A53T组比在ＷＴ组更突出。两组动物存活ＤＡ神经元中都观察到含有α⁃synuclein 聚集体。这在其他啮齿类动物模型中没有观察到，是研究神经保护策略和新药的优秀工具。ＶａｎｄｅｒＰｅｒｒｅｎ等向Wistar大鼠ＳＮ部位注射携带A53T α⁃synuclein 的ｒAAV2/7。３周后，接受剂量为3.0E11GC/mL的大鼠中观察到显著的运动障碍。４周后，注射部位对侧（左）前爪使用率降低了５０％，ＤＡ实验阳性。３２ｄ后，ＰＥＴ成像观察到ＤＡＴ结合率降低高达８５％。免疫组化显示ＳＮ中不溶性α⁃synuclein 阳性聚集体形成。与ＷＴ α⁃synuclein 模型和6-OHDA 模型相比较，A53T 突变诱导的ＳＮ中ＤＡ细胞进行性死亡和α⁃synuclein 阳性聚集物的形成具有时间和剂量依赖性，小鼠显示出运动缺陷。A53T 模型的损伤程度比ＷＴ模型更严重。A53T 模型可能是早发性ＰＤ的合适模型。

恒河猴（大约８岁）和同年龄野生型C57BL/6小鼠（１０个月）相比，猴脑中反应性星形胶质细胞和轴突变性的增加，A53T α⁃synuclein 在猴脑中显示比小鼠更严重的年龄依赖性的神经毒性，且A53T α⁃synuclein 的累积和相关病理学发展是年龄依赖性的。Ｌａｕｗｅｒｓ等采用重组ＬＶ载体将ＷＴ、Ａ３０Ｐ或A53T 三种α⁃synuclein 突变基因导入Wista大鼠ＳＮ，结果显示神经细胞损伤不明显，５个月时大鼠神经细胞损伤２４％～３５％。相对于ＬＶ载体而言，ｒAAV 载体转导效率可能更好、ＤＡ神经元细胞损伤更明显、造模时间更短，AAV 载体转导效果优于ＬＶ载体。ｒAAV 的衣壳血清型也是ＰＤ模型制作重要的考虑因素。与ｒAAV２／１相比较，ｒAAV２／７血清型转导时间更短、ＤＡ能细胞损失更多。AAV１、AAV５和AAV８血清型在ＳＮｃ中转导效率高于AAV２。ｒAAV７血清型在小鼠ＳＮｃ中显示出高水平的α⁃synuclein 表达，并产生了ＤＡ神经元的强烈丧失。病毒载体模型动物的种类、品系和年龄在模型制作时也是应该考虑的。据报道ｒAAV２／９⁃α⁃synuclein 在C57BL/6 小鼠的ＳＮｃ中产生强烈的ＤＡ神经元变性，但其他品系小鼠不产生。提示研究人员在比较基因在ｒAAV⁃α⁃synuclein介导的表型中的作用时，应该在相同的背景下使用同基因品系小鼠。ｒAAV⁃α⁃synuclein模型没有完全概括在ＰＤ患者脑中发现的ＬＢ和路易体神经突的特征。虽然α⁃synuclein 似乎定位于过表达α⁃synuclein 的转导神经元中，但是这些聚集体不具有典型ＬＢ和路易体神经突的形态学特征。