冈崎片段是什么？关于冈崎片段的详细介绍

冈崎片段(Okazaki fragments)是DNA复制过程中，后随链（lagging strand）复制的中间产物，是一系列不连续的长度较短的核酸序列。在真核生物中冈崎片段长度大约为100-200nt；原核生物中则大约为1000-2000nt。冈崎片段是20世纪60年代由日本科学家冈崎令治、冈崎恒子以及其同事在研究噬菌体在大肠杆菌中的复制过程时发现，因此得名冈崎片段。

冈崎片段的发现过程中的三个主要实验

脉冲标记实验

在冈崎片段发现之前，人们已经观察到了DNA复制过程中形成的复制叉（replication fork），但对于后随链的复制是否是连续的仍然未知。因为已知的DNA复制方向都是从5’向3’延伸，而复制叉中后随链的合成方向从3’向5’；而且自然界中已发现的DNA聚合酶都是从5’向3’延伸。因此，冈崎团队提出了一个假设，即DNA的后随链是不连续复制（discontinuous replication）的，是通过5’向3’延伸出多个短的DNA序列，再进行连接从而合成后随链。团队通过脉冲标记实验（pulse-labeling experiment），利用放射性同位素 标记了脱氧胸苷（dTTP），在被T4噬菌体侵染的大肠杆菌细胞与被标记的dTTP结合到特定的时间（2s, 7s, 15s, 30s, 60s, 120s）时终止实验，提取出DNA后发现大量短的放射性标记的DNA产物，这暗示了DNA的复制可能是不连续的。

DNA连接酶温敏突变实验

他们希望弄清楚这些合成出的短链是否是通过DNA连接酶进行连接的，因此，他们用T4噬菌体侵染大肠杆菌，使被侵染的大肠杆菌产生温度敏感型DNA连接酶，发现在高温环境下，由于温敏型DNA连接酶失活，这些大肠杆菌中的新和成的放射性标记短链DNA积累的更多，这进一步暗示了这些合成的DNA短链是通过DNA连接酶进行连接形成更长的DNA链。但是由于这些实验结果显示，被标记的DNA片段都是短链，基于此，当时科学家大都认为DNA复制叉上两条链都以不连续复制进行合成，但却无法解释为什么前导链以5’向3’直接延伸也会是不连续的。

尿嘧啶片段探测实验

为了确定这种不连续复制过程是只发生在一条链还是两条链都如此，科学家利用尿嘧啶片段探测实验进行验证。在自然界中，大肠杆菌DNA复制过程中会有一定几率错误的将dUTP掺入到DNA中从而形成A:U配对的情况，为了避免这种情况的发生，大肠杆菌具有两种修复机制:一是从通过dUTPase将dUTP进行水解生成dUMP和Pi限制其掺入；二是通过尿嘧啶-N-糖苷酶(Uracil-N-glycosylase, UNG)作用，对掺入到DNA中的尿嘧啶糖苷键进行切割，形成脱嘌呤/脱嘧啶位点(Apurinic/Apyrimidinic site， AP site)，随后再由脱嘌呤嘧啶核酸内切酶(Apurinic/Apyrimidinic Endonucleases)进行切割引发切除修复。通过对大肠杆菌dUTPase缺陷突变体进行类似的脉冲标记实验发现，实验获得了更多更短的新合成DNA片段，这是因为dUTPase缺失突变体中，dUTP更容易掺入DNA，被UNG切割后，没来得及修复，被裂解后使得产生了更短的新合成产物；而利用大肠杆菌UNG缺失突变体进行脉冲标记实验则发现，新合成的DNA片段中，只有一半是DNA短链，这是因为由于没有UNG对尿嘧啶糖苷键进行切割，因此不会出现由于切除误掺入DNA的dUTP而造成的短链产物，而只保留了以不连续短链进行合成的冈崎片段。

通过这些实验结论，科学家推测，DNA的复制是半不连续复制(semi-discontinuous replication), 即前导链(leading strand)是连续复制而后随链（lagging strand）是通过合成多个短的不连续的冈崎片段的方式进行复制。

冈崎片段的合成方式概述

在DNA复制过程中，DNA解螺旋后，首先需要由引发酶（primase）合成RNA引物，从而使DNA聚合酶能以此为基础由5’向3’延伸合成DNA链，冈崎片段合成方式也是如此。在原核生物中，如大肠杆菌，它的引发酶是DnaG，需要与解旋酶DnaB，聚合酶pol III结合形成引发体（primosome）产生活性合成RNA引物。在真核生物中，通常由primase-DNA polymerase α (Prim-Pol α)合成RNA-DNA杂合引物，再由DNA聚合酶δ和聚合酶ε进行复制延伸。在两个冈崎片段的连接部位，DNA聚合酶δ会继续合成以替换掉RNA引物，使得RNA引物部分翘起而产生一个翘起结构(flap structure)，此时需要对翘起的RNA-DNA引物进行切除，其主要方式是通过Flap切割途径（Flap pathway）和外切酶途径（Exonucleolytic pathway）。随后，由DNA连接酶I(DNA ligase I) 对两个冈崎片段进行连接。

冈崎片段的生物学意义

由于DNA的两条链反向互补，在合成过程中新合成的两条链需要以母链(parental strands)为模板从同一个复制起点向两个方向同时进行合成，在一个复制叉上，两条子链的复制合成方向相同，但自然界中已发现的DNA聚合酶都是以5’向3’进行延伸，因此只有前导链可以按照这个方向进行延伸，而后随链却不能反向延伸。生物体通过以从5’向3’反复合成多条冈崎片段并进行连接的方式，合成后随链，解决了这一矛盾并保证了DNA双链复制的完整性，这种前导链连续复制和后随链不连续复制即DNA合成的半不连续复制现象在生物界中普遍存在。 而冈崎片段缺失突变，可能会引起DNA断裂以及染色体异常的情况，造成染色体形态、数量、倍型的变异。由于基因是染色体上的DNA序列，因此也会造成基因突变，进而影响物种的基因池。

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