氢水预防胆管癌实验研究【全文】

前面我们已经摘要介绍了该文章，受到氢粉的热读，这里将全文介绍给大家，希望能加深理解。

氢气作为一种健康促进工具，理论上最重要的是提高健康水平，延缓慢性病发生，预防和推迟恶性癌症发生。在癌症预防方面，2010年日本学者有预防原发性肝癌的研究。这次有于教授预防胆管癌的研究，过去也有关于膀胱癌和结肠癌的相关研究。这个方向仍然值得大家进一步探索，这将给氢气医学应用提供重要的理论支持。

一、介绍

中国的癌症发病率和死亡率一直在快速上升。中国流行癌症，如肝癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌和宫颈癌的发病率仍然很高，一些与不健康的生活方式和环境污染有关的癌症，如肺癌、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌，在过去十年中急剧增加(Chen et al.， 2016)。这种增长最普遍接受的原因是迅速的工业化和城市化伴随着生活方式和环境的急剧变化。对财富的过度追求导致不可逆转的环境快速恶化，这与癌症发病率和死亡率的增加相关。“癌症村”的存在为癌症发病率与环境致癌物之间的因果关系提供了证据(Lu et al.， 2015)。虽然政府正在大力扭转环境污染可从根本上解决部分问题。但是仍然需要一种“预防”癌症发生的替代策略。

化学药物预防是指使用天然、合成或生物制剂来避免、延迟、逆转或抑制癌症的起始和进展(Walczak et al.， 2017)。理想的化学预防剂是可以在不产生严重副作用的情况下，对患癌症的高危人群长期使用。在观察性研究和临床试验中，阿司匹林、二甲双胍和他莫西芬等药物可以降低癌症发病率，且副作用有限。长期服用阿司匹林可以降低癌症的发病率和死亡率，特别是在大肠癌和胆管癌。最近的一项临床试验表明，低剂量二甲双胍可以降低息肉切除术后异时性腺瘤和息肉的患病率和数量。然而，阿司匹林(胃肠道出血)和二甲双胍(胃肠道紊乱)的有害影响是潜在的副作用，在标准治疗方案中仍然可能无法接受，甚至在标签外用于癌症预防中也无法接受。这项研究旨在探索一种更安全、更自然、更容易接受的替代物质实现预防癌症的目的。

氢气具有作为一种“新型”抗氧化剂在预防和治疗方面应用的潜力(Ohta, 2011)。2007年《自然医学》杂志报道了氢气对脑梗死模型大鼠的积极治疗作用(Ohsawa et al.， 2007)。此外，大量研究已经在广泛疾病模型、人类疾病和治疗相关病理中探索了氢气的治疗效果(Ichihara et al.， 2015)。这些疾病大多与氧化应激相关疾病和炎症性疾病有关。氢气的抗肿瘤作用研究由来已久。1975年，Dole等人在《科学》杂志上首次报道了一种含有97.5%氢气的溶液可以减少裸鼠鳞状细胞癌的生长。最近的研究表明，氢可以抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成，同时减少放疗和化疗的副作用。这些数据支持氢气在人类实体癌症中的化学预防和治疗潜力。在前期研究中，我们已经证明，长期使用氢水可以降低42.9%的硫代乙酰胺诱导大鼠胆管纤维化。在这里，我们使用人工智能算法对这些样本进一步的研究，并探索了其可能的机制。

二、实验方法

2.1 动物模型

所有实验程序均由中国上海同济大学附属东方医院实验动物伦理委员会批准。本研究共进行了三个实验。第一项研究招募了20只 SD大鼠，将它们分为两组:每天饮用普通水和氢水。这些大鼠未被给予硫代乙酰胺。本实验用于确定长期使用富氢水的安全性以及富氢水是否能改善生活质量(补充图S1)。

第二组选取38只成年雄性SD大鼠(300-370 g)，分别给予含或不含富氢水的硫代乙酰胺 5个月。将大鼠分为硫代乙酰胺组(n = 19)和硫代乙酰胺 +氢气组(n = 19)。所有大鼠每天在其饮用水中给予300 mg/L的硫代乙酰胺，直到处死。此外，试验组每日口服1.8 mg/L富氢水2ml，对照组常规水2ml。治疗8周后，每组每月处死3只动物，取肝脏检测硫代乙酰胺的致瘤作用和氢气的预防作用。动物每周称重。

第三组招募30只成年雄性SD大鼠。各组大鼠灌服相同的硫代乙酰胺水3个月后停止饮水，分为普通水组和富氢水组。本实验用于检测富氢水是否能阻断CCA的进展。

2.2 肝脏的采集程序和组织病理学评价

在指定的时间，以CO2流量(每分钟笼子体积的10-30%)处死所有动物。在中线剖腹手术后，评估所有肝叶的疾病，然后切除。仔细检查肝脏的大体形态并进行评分。测定肝脏表面病变的数量。下腔静脉采血，检测肝功能和其他生理指标。用水洗肝，切成3- 5mm的切片;每个肝脏样本的一半保存在−80°C，另一半固定在4%多聚甲醛中。统计各组织切片的病变数量。

为了客观、定量地评估病变，我们开发了一种基于卷积神经网络(CNNs)的自动病变检测框架，用于肝脏病变的检测。首先使用Otsu阈值算法从整个图像(WSIs)中提取组织区域，然后进行形态学运算，计算相应的组织面积Atissue。随后，提出了基于深度学习的病变自动检测框架，从组织区域检测和定位纤维化和癌症区域。该框架由斑块级分类和后处理过程组成，用于生成WSI的病变似然图。我们以滑动窗口的方式在组织区域运行局部CNN分类器。对于每个斑块，使用分类器给出病变概率。然后对概率进行累积，得到WSI的可能性图。然后，对似然图进行归一化，使每个像素都有一个从0到1的连续似然。为了获得病变区域Alesion，似然图的阈值为0.9，以去除低似然区域。已知WSI的整个组织面积(Atissue)和病变面积(Alesion)，可以计算比值= Alesion/Atissue。

2.3 RNA-Seq

对上海大江生物技术有限公司第一次实验中仅给予硫代乙酰胺的4只大鼠和给予硫代乙酰胺 +氢气的4只大鼠，使用正常的肌肉或肠道组织以及有病变的肝脏进行测序和分析。

2.4免疫组织化学

取第一次实验大鼠皮肤和第二次实验大鼠肝脏，用中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋。

2.5采用高通量测序法分析第二次实验大鼠肠道菌群

在使用TopTaq DNA聚合酶试剂盒(Transgen，中国)进行DNA分离之前，从第二次实验的大鼠结肠中收集粪便样本，置于−80°C保存。

2.6数据预处理与分析

所有数据集均为来自肠道微生物群落的16S rRNA基因扩增子测序数据，首先从原始数据中删除低质量reads (Q < 20)。然后使用USEARCH去除非特异性扩增子、错误率为>2的reads、单例序列和嵌合序列，以获得干净的数据。合格序列以与UPARSE 97%的相似性聚类成操作分类单元(OTUs) (Edgar, 2013)。利用核糖体数据库项目(RDP)对OTUs的代表性序列进行分类。我们使用软件包计算了α-和β-多样性R。我们使用Bray - Curtis非相似性指数和UPGMA连锁法进行聚类分析。采用典型对应分析(CCA)分析dicqa对微生物组成的贡献。采用线性判别分析效应分析各组微生物群落的差异。

2.7统计数据

所有统计分析均采用SPSS和GraphPad Prism(5.0版)软件进行。分类资料采用χ2检验进行分析。两组间的差异用双尾t检验确定。三组之间的比较应采用方差分析和事后检验进行评估。p值小于0.05被认为具有统计学意义。

三、结果

3.1长期使用氢水的安全性和生活质量影响。

在所有实验中没有硫代乙酰胺或药物相关死亡率的实例。第一个实验主要集中在富氢水使用的安全性。与对照组相比，使用氢水9个月未引起包括心脏、肝脏和肾脏在内的内脏器官的任何病理改变(图1A)。两组间AST和ALT水平无显著差异(图1B)。然而，在此期间，我们观察到两件令人兴奋的事情:饮用富氢水的大鼠的毛发比不饮用富氢水的大鼠的毛发更白、更有光泽(图1C);前者的精子活力高于后者(图1D)。此外，HE和IHC染色显示，前者大鼠比后者大鼠的毛囊更致密，增殖活性更高(图1C)。

图1.长期使用富氢水的安全性及其对大鼠生活质量的影响。

3.2富氢水抑制硫代乙酰胺诱导的胆管纤维化形成。

肝脏的连续采集如图2A所示。将肝脏表面和各肝脏切片上的肿瘤结节进行彻底计数并制成表格(图2B)。硫代乙酰胺组大鼠(9/9,100%)和硫代乙酰胺 +氢气组大鼠(28.6%，2/7)均出现可见的肝脏白色结节。总的来说，硫代乙酰胺组肉眼可见白色结节的平均数目为7.4±5.7，明显高于硫代乙酰胺 +氢气组(1.3±2.6)。

图2.各组20周时肝内病变的发生率。(A)分别于8、12、16、20周处死3只大鼠(硫代乙酰胺和硫代乙酰胺 +氢气)。(B)肝表面及肝内白色结节计数。(C)基于卷积神经网络(CNNs)开发了自动组织学分类来评估肝脏病变。两组肝脏切片具有代表性的全片图像(H&E:上部;人工智能:低)。人工智能,人工智能。(D) AI算法评估两组肝脏病变的比例。(E)光镜下计数两组显微镜下胆管纤维化数。

肝脏病变最明显和最重要的特征如下:纤维化(以α-SMA表达为特征)(补充图S2A,E)和胆管纤维化(以CK7和CK19过表达为特征)(补充图S2B-D)。在这里，我们开发了一个基于深度学习卷积神经网络(cnn)的自动病变检测框架。该人工智能算法清晰地显示了WSIs中肝脏病变的位置和数量(红色)(图2C)。硫代乙酰胺组AI识别的纤维化病变比例为19.6%±9.01，明显高于硫代乙酰胺 +氢气组(7.53%±11.0)(图2D)。我们还在光学显微镜下计算了显微“肠道型”CCAs。硫代乙酰胺组所有大鼠(100%，9/9)均出现镜下胆管纤维化，镜下平均12±10.1只大鼠。值得注意的是，在硫代乙酰胺 +氢气组中，只有57.1%(4/7)的大鼠发生了显微镜下的胆管纤维化，每只大鼠的病变率为2.9±5.4个，而其他42.9%的大鼠没有任何可检测到的胆管纤维化。硫代乙酰胺组的胆管纤维化发生率明显高于硫代乙酰胺 +氢气组(p = 0.0487)(图2E)。这些数据提供了第一手证据，富氢水可以抑制胆管纤维化的发展。

3.3 氢水可防止硫代乙酰胺诱导的纤维化和胆管纤维化的进展。

顺序观察发现，硫代乙酰胺组肝脏形态在12周时开始恶化，在16周和20周时显著恶化。在硫代乙酰胺 +氢气组中，肝脏形态在16周时开始恶化，只有28.6%(2/7)的病例在20周时出现恶化(图3A,B)。

图3.使用或不使用富氢水诱导硫代乙酰胺时肝脏病变的显微镜图。(A)指定时间点肝脏的代表性大体图像。(B)补充或不补充富氢水的硫代乙酰胺治疗肝脏状态示意图。(C)人工智能算法分析的指定时间点肝脏胆管病变的代表性图像。(D) AI算法在指定时间点的代表性玻片上评估肝脏胆管病变的比例。

我们通过人工智能算法分析了在富氢水处理存在或不存在的情况下，硫代乙酰胺诱导产生的显微镜下肝脏病变。硫代乙酰胺组肝脏病变比例随时间急剧增加(图3C上、图3D左)，而硫代乙酰胺 +氢气组肝脏病变比例仅在16周时增加，之后降至较低水平(图3C下、图3D右)。这些数据进一步证实氢气治疗延缓了纤维化向胆管纤维化的进展。

3.4氢减少糖酵解并阻断增殖胆管细胞与微环境之间的交互影响。

接下来，我们使用RNA-seq分析，分析当硫代乙酰胺诱导的胆管纤维化用富氢水处理时发生的变化。不出所料，我们观察到这两组之间的基因表达谱存在显著差异(补充图S3A,B)。氢气处理显著影响多个信号通路(补充图S3C,D)，包括细胞粘附和炎症相关通路的基因。经硫代乙酰胺处理，S100家族的多个成员数量增加，富氢水使这些基因的表达下调了3到5倍(图4A,B)。进一步分析发现，硫代乙酰胺 +氢气组ERBB2下调。此外，我们发现糖酵解中的三种限速酶，己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶，在接受富氢水的大鼠中下调了2到4倍(图4C)。

图4.RNA-seq分析显示硫代乙酰胺组和硫代乙酰胺 +氢气组的肝脏之间存在差异基因表达

3.5氢能阻断硫代乙酰胺引发的胆管纤维化。

虽然氢气降低了硫代乙酰胺诱导的胆管纤维化模型中胆管纤维化的发生率，但通过对肝脏病变的rna测序分析，氢气干预并不影响突变比例(图5A,B)。考虑到某些肿瘤在第一代迁移时的高死亡率可以在下一代中降低，我们模拟了这种情况，在不进行任何干预的情况下喂养SD大鼠3个月后去除硫代乙酰胺(图5C)。如果不治疗，100%的大鼠(7/7)在第6个月出现镜下胆管纤维化。而给予富氢水6个月后，只有12.5%(1/8)的大鼠出现镜下胆管纤维化。AI算法还证实，在氢气干预下，硫代乙酰胺预处理大鼠的ales/ Atissue比例显著降低(图5D,E)。

肠道菌群组成

考虑到氢水可以缓解便秘，我们研究了氢气如何影响肠道菌群的组成。即使在这个小的队列中，我们也观察到两组之间的alphaDiversity有显著的差异(图6A)。总的来说，硫代乙酰胺-regular water组肠道菌群的平均数量为1626个，硫代乙酰胺-氢气组肠道菌群的平均数量为1589个，交集数为1196个(图6B)。氢气处理5个月后，不同分类水平的菌株的相对丰度发生显著。

图5.长期使用氢水可以阻断硫代乙酰胺引起的胆管纤维化。

3.6 氢改变肠变化，包括科、属、目、门和种(图6C)。聚类分析将所有大鼠清晰地分为不同组(图6D)。

图6.氢改变了肠道菌群的组成。

四、讨论

2012年，癌症死亡率是全球第二大死亡原因，如果不做出改变，最终可能成为头号死亡原因。由于快速工业化和城市化导致的生活方式选择的严重改变和环境恶化，中国的情况尤其糟糕。“精准医疗”的概念吸引了大量研究投资。然而，对于发展中国家或地区来说，新的癌症药物治疗和分子检测方法日益增长的费用是难以持续发展的。对于这一潜在健康和经济灾难，最有吸引力的解决方案是“预防”。除了避免风险因素和保持健康的生活方式，预防癌症发生的化合物可以提供一个有效的预防方法来降低癌症风险。然而，用于癌症预防的研究资金占所有癌症研究资金的比例不到3% (Albini等人，2016)，这一数字在发展中国家甚至更低。这些资金不足以开发毒性最小的有效癌症预防药物。现有的药物，如阿司匹林、二甲双胍和他莫西芬，可能是有用的替代品。最近，40岁至69岁之间有正常出血风险的个体被证明受益于每天服用阿司匹林，用于心血管疾病和结直肠癌的一级预防(Dehmer et al.， 2015)。然而，胃肠道(GI)和脑出血风险的增加使得在某些情况下预防性使用阿司匹林是不可接受的。在这里，我们证明了分子氢是一种有效和安全的癌症预防方式。

胆管癌(CCA)是一种实体瘤病变，由多种上皮肿瘤组成，伴有晚期诊断和不良预后。胆管纤维化是一种有争议的肝内胆管病变，存在增生性、化生和炎症成分，在化学诱导的大鼠模型中，胆管纤维化先于胆管癌的发展。在啮齿类动物模型中，胆管上皮表现出独特的形态特征，包括由嗜碱性高的化生上皮(肠上皮化生)组成的扩张腺体，如先前所提出的被称为“肠型胆管癌”。该模型是理想的试验疗效的胆管纤维化肿瘤开始前。在对该模型进行了5个月的氢分子治疗后，我们从两个方面评估了这些治疗的预防效果:我们开发的人工智能算法识别的肝脏病变和显微镜下的胆管纤维化。正如预期的那样，接受富氢水治疗的大鼠肝脏病变的比例比未接受治疗的大鼠要好得多。此外，我们发现，富氢水处理后，可见和显微镜下肝纤维化的数量减少。总的来说，这些数据证实了富氢水在预防癌发生作用。重要的是，我们没有观察到长期使用氢水的任何副作用。是否饮用氢水可以用于预防高危人群的癌症还需要进一步的研究。

一些研究提出，分子氢作为一种抗氧化剂猝灭活性氧(ROS)。随后的研究表明，氢分子可以抑制炎症中的多个信号通路和下游靶点。氢还可以改变信号分子的活性和表达水平，包括NF-kB p65或NF-kB、STAT3、GSK-3ß、JNK、Ras、ERK和JNK。在我们的研究中，我们发现氢可以抑制ERBB2过表达，而ERBB2过表达是加速CCA肿瘤发生的驱动因素。癌症细胞的一个独特特征是通过糖酵解产生能量和合成代谢，同时高水平的限速酶催化糖酵解的第一步(HK)、中间(PFK)和最后一步(PKM)。氢具有减弱这一代谢过程的能力，表明它可能通过调节糖酵解抑制肿瘤的发生。胆管癌的特点是炎性细胞浸润和肿瘤间质不受控制的增生。我们的分析表明，当长期饮用氢水时，S100家族成员(S100A4、−6、−8、−9、−10和−11)的表达水平显著降低。S100蛋白促进增殖细胞和基质细胞之间的通信，包括成纤维细胞、内皮细胞和炎症细胞(肿瘤相关巨噬细胞、骨髓源性抑制细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞)。长期使用富含氢的水似乎会破坏这种癌-间质相互作用。

癌症拦截作用包括早期阶段癌症发展过程的中断，以减缓甚至逆转转化病灶肿瘤块的生长(Albini等，2016)。我们的研究中，旨在进一步评估分子氢在减少癌症进展中的拦截策略。为了测试这个问题，我们已经首先用硫代乙酰胺对大鼠进行了三个月的处理，然后再用氢水对大鼠进行治疗。最后的结果表明是有效的。当给予氢水时，没有大鼠发生胆管纤维化，肝脏病变比例显著降低，说明分子氢有可能中断癌症的发展过程。这一结果为那些已经暴露于污染物一段时间再使用氢水预防癌症人提供了一个潜在解决策略。

肠道菌群和癌症发生等慢性炎症相关疾病有密切关系，氢水对便秘有一定缓解作用。为了研究为什么长期使用氢水可以缓解便秘和预防癌症的发生，我们对硫代乙酰胺预处理的大鼠的粪便样本进行了全基因组鸟枪测序，这些大鼠的粪便样本有或没有随后的氢水干预。氢确实导致肠道菌群组成的显著变化。氢的使用降低了clostridiaceae_1的丰度，这与抗生素治疗引起的炎症相关(Unno et al.， 2015)。以将多糖发酵成短链脂肪酸而闻名的瘤胃球菌减少了，而与肥胖状态下炎症升高相关的turicibacter通过氢的使用增加了(Jiao et al.， 2018b)。科里杆菌科的成员被认为是健康胃肠道微生物群的指标(Krogius-Kurikka等人，2009)。氢可以上调放线菌的丰度，这在许多病理条件下显示了有益的作用(Binda等，2018)。我们的发现支持了这样一种观点，即改变的肠道微生物群介导了氢对中断肿瘤进展和改善生活质量的影响。目前尚不清楚这些肠道微生物群的变化是否与宿主的生理功能有关，需要进一步研究以了解每个改变的分类单元在维持体内平衡中的作用。

总之，我们的数据首次表明，长期使用氢水可以防止肝损伤，并显著降低化学诱导的胆管纤维化的发病率。富氢水可改善大鼠的生活质量。这些结果表明，长期使用富氢水是安全有效的。氢消耗显著降低了糖酵解和S100家族关键蛋白的mRNA水平，这可能与分子氢抗氧化活性有关。我们的结果还表明，在胆管纤维化的起始阶段，氢的使用抑制了潜在的致病菌。但是，我们的研究结果都是描述性的证据，不能揭示氢气的直接机制和直接靶向器官。需要更多的研究来确定氢依赖在癌症预防中的潜在机制，并探索其潜在的临床价值。

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温馨提示：根据《食品药品监督管理条例》，氢气不能替代药物治疗。