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顶级临床研究模板 期刊简介  研究背景 特应性皮炎（Atopic dermatitis；AD）是一种常见的皮肤疾病，以剧烈瘙痒和湿疹样皮损为主要特征。全球儿童患病率为 15%至20%，成人为1%至3 %。研究发现大量金黄色葡萄球菌定植于AD患者皮肤表面，并通过促进炎症加剧疾病进程。正常人类皮肤表面微生物群落相互依存又相互制约可维持皮肤、黏膜表面的菌群平衡。一些与皮肤共生、血浆凝固酶阴性菌株（CoNS）产生的细菌素可以选择性地抑制皮肤表面上的非常驻致病菌，如金黄色葡萄球菌、A 组链球菌和大肠杆菌的生长繁殖。 本研究中作者从健康受试者的皮肤中筛选出一种CoNS菌株—人葡萄球菌A9 （ShA9），发现ShA9有效杀灭小鼠皮肤上的金黄色葡萄球菌，并抑制了金黄色葡萄球菌中促进炎症的毒素（psmα）的表达。本研究一方面采用临床前AD小鼠实验模型来评估ShA9潜在的治疗作用及其机制，并进行了随机双盲对照的临床试验进一步考察其对AD患者的安全性及有效性。 文献解读 1 人体皮肤共生菌中有益菌的筛选及临床前实验 从健康受试者的皮肤中筛选出8000多株CoNS细菌，并从中筛选出能够抑制金黄色葡萄球菌生长的菌株，然后进一步评估了这些菌株的其他特性，比如恢复受损皮肤屏障的能力，对常见的抗生素敏感，对金黄色葡萄球菌抑制的选择性等。基于这些标准，作者最终选择人型链球菌 （ShA9） 菌株用于 AD小鼠模型的临床前研究。 通过一天两次涂抹卵清蛋白（OVA）溶液致敏并与金黄色葡萄球菌定植3天建立AD小鼠模型，然后在背部涂抹ShA9 菌株3天，观察其疗效。如图1所示： 1. ShA9能够抑制金黄色葡萄球菌的存活，并有效改善皮肤表面局部红斑现象（图1a） 2. 皮损评分（g）和经皮失水率TEWL（h）也显著性降低（图1b） 3. ShA9能够抑制AD炎症反应，有效降低IL-4、IL-13、TSLP、IL-17、IL-22等与AD密切相关的炎症因子的水平（图1c） 此外，由于TH2细胞因子如IL-4和IL-13的抑制作用，AD患者某些宿主防御肽的相对表达水平较低，应用ShA9可增加抗菌肽Camp（图1d）, mDB14（图1e） 和 mBD4（图1f）的mRNA的表达。表明ShA9除了具有直接抗菌作用外，还能增强宿主的抗菌防御系统。 2 ShA9的抗炎活性不依赖于杀死金黄色葡萄球菌 已有文献发现，ShA9可产生两种对金黄色葡萄球菌具有抑制作用的活性的羊毛硫抗生素（隶属于抗菌肽）。为了研究在局部应用ShA9后观察到的抗炎活性是否依赖于杀死金黄色葡萄球菌，通过等位基因交换删除了ShA9中的两个羊毛硫抗生素基因。如图2所示， 1. 与野生型（WT）ShA9 相比，突变型ShA9菌株（ShA9-Δlanti）在琼脂上的生长良好，表明野生型的ShA9能杀死金黄色葡萄球菌，而突变型ShA9菌株却不能（图2a） 2. 突变型ShA9 菌株（ShA9-Δlanti）与ShA9的WT亲本菌株的效果比较显示，ShA9-Δlanti 抑制金黄色葡萄球菌在小鼠皮肤上繁殖的能力大大降低（图2a） 突变体ShA9 菌株不能有效杀死金黄色葡萄球菌，但保留了其抑制炎症反应的能力，IL-4（图2c）、IL-13（图2d）、IL-17（图2e）的mRNA表达水平都降低，恢复了 Camp 的表达（图2f）,并且能够抑制Th2和Th17细胞的浸润（图2g-i）。另外，作者发现突变ShA9-Δlanti 菌株与野生菌株在抑制酚溶调控蛋白-α (PSMα) 的mRNA 表达方面作用相当（图2j），PSMα是一种受群体感应控制并促进皮肤炎症的金黄色葡萄球菌毒素。图2的结果表明，突变型ShA9-Δlanti菌株尽管不抑制金黄色葡萄球菌的生长，但仍能抑制炎症反应，保留了其抑制群体感应的能力。 3 ShA9对AD患者皮肤的安全性评价 基于以上观察结果，作者提出ShA9 可以通过三种机制发挥缓解AD作用（图3a）： 1. 直接杀死金黄色葡萄球菌 2. 抑制群体感应（群体感应是细菌根据细胞密度进行基因调控的一种生理行为，能够改变细菌的毒力基因的表达等） 3. 促进其他共生体的保护功能 图3b是对金黄色葡萄球菌定植的 AD 成人患者局部应用ShA9的临床研究方案设计。 作者以人体安全性作为主要终点，设计了一项1期随机、双盲、对照的临床试验，纳入54名成人中重度AD患者，皮肤金黄色葡萄球菌感染阳性，其中36人接受ShA9治疗，18人作为对照。在7个时间点取皮肤拭子：分别是第1天第一次涂抹之前和之后的1h，在给药的第4天和第7天，第7天最后一次给药后的24、48和96h。 表1显示了AD 成人患者局部应用ShA9在8天内不良反应发生率。ShA9治疗组的总不良反应发生率是55.6%，安慰剂对照组不良反应发生率达到83.3% (P = 0.044)。 表2显示的是主要的不良反应评判事件有eczema（湿疹）、pruritus（瘙痒）、pain in extremity（四肢疼痛）、peripheral swelling（肿胀）、abdominal pain upper（上腹痛）、abdominal discomfort（腹部不适）、furuncle（疖子，金葡菌引起的化脓性感染）、dysmenorrhea（痛经）等。 4 ShA9对AD的局部治疗效果及原理 图3c-j表明，局部应用ShA9可减少AD患者金黄色葡萄球菌的定殖，AD患者局部炎症的改善与ShA9杀灭金黄色葡萄球菌相关。 （图3c）皮损区和非皮损区7个时间点皮肤表面葡萄球菌的数量。ShA9 减少了AD患者病变和非病变皮肤上金黄色葡萄球菌菌落形成单位。 由于ShA9的抗菌活性对某些金黄色葡萄球菌菌株具有选择性，包括对AD26的临床分离株的选择性，因此作者还测量了从每位参与者基线拭子中回收的金黄色葡萄球菌的分离株对体外ShA9的敏感性。大多数个体都被对ShA9抑制生长敏感的金黄色葡萄球菌菌株定殖。在第7天和随访阶段，参与者对皮肤杀死的敏感性与参与者皮肤上金黄色葡萄球菌丰度的变化有关。通过相关性分析，分析了皮肤表面的金黄色葡萄球菌丰度与ShA9的敏感性之间的关系（图3d） 。 接下来作者从AD患者身上回收了没有被ShA9杀死的金黄色葡萄球菌，多肽耐药因子（mprF）是一种由金黄色葡萄球菌表达的基因，之前已报道该基因抑制抗菌肽（AMP）的表达。与野生型金黄色葡萄球菌相比，敲除mprF的金黄色葡萄球菌组（ΔmprF）对ShA9敏感性更强（图3e）。 而从AD患者中分离出的金黄色葡萄球菌中mprF的表达量更高，则对ShA9的抗菌活性更具耐药性（图3f）。 对ShA9敏感或耐药的金黄色葡萄球菌定植的AD患者皮损表面金黄色葡萄球菌mprF mRNA的丰度（图3g）。对ShA9耐药的金黄色葡萄球菌定植的AD患者损伤皮肤中mprF的mRNA表达量更高。这些数据表明，金黄色葡萄球菌的 mprF表达会影响 ShA9 直接抑制金黄色葡萄球菌存活的能力。 相关性分析图展示的是ShA9抑制敏感的金黄色葡萄球菌生长的能力和湿疹改善评分之间的关系（图3h），可以看到ShA9的杀菌能力越强，患者湿疹改善越好。 图3i和图3j是做的7个时间点的EASI和SOORAD评分变化曲线，可以看到对ShA9敏感的AD患者，湿疹评分显著降低的，并且这种作用持续到了末次给药后的96h。这些观察结果支持金黄色葡萄球菌在AD 发病机制中的作用，并表明局部应用合理的人类共生菌可以使部分AD 患者受益。 5 ShA9在病变区皮肤上的存活和转录活性 接下来作者研究了ShA9改善AD第二个机制——ShA9对群体感应的作用（图4）。首先是评估了ShA9在皮肤上的持久性，通过测量总CoNS 的菌落计数作为 ShA9丰度的替代测量。 在图4a中，作者分别检测了皮损和非皮损部位的有益菌CoNS的丰度。可以看到在第一次应用ShA9 后1小时，损伤和非损伤皮肤均显示皮肤上的活CoNS 增加3到4个对数，对照组没有变化。接受 ShA9 治疗的参与者在第4天和第7天非病变皮肤上 CoNS 数量更多。有趣的是，即使在最后一次应用后 96 h，在非病变皮肤上仍检测到更高水平的CoNS菌株。 图4b记录了病变皮肤中AIP（自诱导肽）mRNA的表达 。为了评估ShA9的转录活性，可以看到AIP（自诱导肽）和抗菌肽这两个基因的mRNA水平都明显升高，在治疗后96h也维持在较高的水平。虽然局部应用ShA9 1h后皮损区有益菌的丰度就开始降低了，但是ShA9代谢产物在病变区和非病变区都能维持在较高水平。 金黄色葡萄球菌的重要毒力因子psmα（图4c），它是群体感应下游的一个毒素，它的表达和AIP的表达是呈负相关的，经过治疗之后psmα的表达下降。 图4d是评价了psmα和EASI评分之间的相关性，可以看到在ShA9治疗组中，局部EASI评分的改善与金黄色葡萄球菌psmα表达降低有关。 接下来作者建立了小鼠AD模型来验证ShA9对psmα的抑制作用是否与杀死金黄色葡萄球菌有关（图4e），小鼠分别用高表达和低表达psmα的金黄色葡萄球菌来定植，采用ShA9局部治疗后，ShA9并没有杀死高表达psmα的金黄色葡萄球菌，但是却大大减少了低表达psmα金黄色葡萄球菌的定植。 图4f-i展现的是病变背部皮肤中psmα（图4f）、IL-4（图4g）以及Camp（图4i）mRNA的表达水平，以及在每组（i）中观察到的皮肤炎症请情况。不管金黄色葡萄球菌是高表达psmα还是低表达psmα，ShA9都能降低psmα和IL-4的表达水平，同时恢复Camp的表达。也改善了由金黄色葡萄球菌定植导致的炎症反应。 这些数据表明这些数据表明，ShA9 的应用通过抑制群体感应系统对抗金黄色葡萄球菌定植，并且这种保护作用与ShA9这可以独立于ShA9羊毛硫抗生素直接杀死金黄色葡萄球菌。 6 ShA9对AD皮肤微生物群的选择性 最后作者探究了ShA9促进其他皮肤共生群的影响（图5）。为了研究 ShA9 对 AD 病变皮肤整体细菌群落的影响，作者对16S核糖体RNA基因的 V1-V9 进行了全长测序。 细菌组学分析发现在ShA9治疗组中（图5a），金黄色葡萄球菌的序列读取频率大大降低（黄色），并扩大了人型葡萄球菌的比例（绿色）。 主成分分析（图5b）表明，与对照组比较，ShA9组在治疗后96h的微生物组成发生了明显改变。 减去人型葡萄球菌后，显示了局部应用ShA9组或对照组皮肤细菌种类的相对比例（图5c-d）。ShA9治疗增加了表皮葡萄球菌的比例（蓝色的），对照组中并没有出现。 图5e和图5f是金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所占的比例，表皮葡萄球菌增加的比例要高于金黄色葡萄球菌降低的比例。 皮肤菌群的结果表明局部应用ShA9 可能促进其他CoNS物种（有益菌）在AD病变皮肤上的重新定植。 总结 作者在结论部分提出采用共生微生物治疗AD的新方法在1期随机临床试验中显示是安全且有效的, 有效避免了类固醇和其它靶向作用宿主机体免疫系统的药物所产生的副作用。并且局部应用 ShA9 后，耐药的金黄色葡萄球菌也未被检测到。当然也需要进一步研究以评估这种方法对AD患者进行细菌治疗的长期风险和益处。 采用细菌疗法治疗疾病并不是特别新奇的点，癌症、结肠炎等疾病中均有相关的报道。而采用通过筛选皮肤表面的有益共生微生物来治疗皮肤疾病，创新点强。并且，作者在前期动物实验上进行了深入的机制探讨，1期临床试验上也进行了安全性和有效性的初步验证，有较强的实际应用价值，想必这也是它能被nature子刊接收的重要原因！这篇论文的确是高分临床文章的代表性佳作。 参考文献：Nakatsuji T, Hata TR, Tong Y, et al. Development of a human skin commensal microbe for bacteriotherapy of atopic dermatitis and use in a phase 1 randomized clinical trial. Nat Med. 2021, 27:700-709.  国庆节的祝福，就不给你整虚的！  做科研5年了，会做多少实验，发表多少篇SCI才算正常水平？ 刚刚公布！国自然基金委重要通知！ |
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