功能基因筛选的基本策略目前,国内外进行功能基因筛选研究的基本策略包括:(1)通过表达谱差异分析、生物信息学分析和基因克隆等途径获得候选基
因;(2)对候选基因进行功能评价(identificationoffunction,可在基因组?、转录、蛋白质组和代谢产
物等水平进行);(3)基因功能确证(validationoffunction);(4)决定开发战略。1.1差异表达
筛选功能基因获得候选基因的研究路线之一是通过正常和疾病组织的表达谱差异分析(expressionprofilingofnor
malanddiseasedtissues)获得疾病的相关基因,进一步进行基因功能的筛选研究(图1)。该筛选策略与疾病过
程密切相关,较多地应用于新药及治疗靶点的发现[1～3]。1.2?生物信息学?分析确定候选功能基因获得候选基因的另一研究路线是
通过生物信息学?分析(bioinformaticanalysis)预测、选定基因序列、克隆获得候选基因,进一步进行基因功能的
筛选研究(图2)[4]。该研究策略筛选范围广,多用于新基因的功能探索研究。用于生物信息学分析的数据资料,主要来源于DNA?芯
片技术和其他相关技术测定的基因表达信息[4]。通过与已知基因或蛋白质序列的分析、比较,可以确定候选研究基因序列长度,提供该未知
基因产物信号转导通路、细胞结构蛋白类型和细胞定位等预测信息[5]。然而,由于人类基因组中约1/3的基因序列与其他基因无同源
性,因此这些基因的功能不易进行直接预测。另一方面,蛋白质的功能表现还与其所处的分子环境有关,一种蛋白质实际上与相邻蛋白质形成了功能
网络(functionalnetworks)。因此,生物信息学中的功能网络数据库分析,对于了解复杂信号通路及与其他基因产物的关
系,可能会提供有价值的参考信息[6]。1.3其他除上述研究策略外,其他途径的功能基因研究也在进行,如直接从正常或疾病组织中
克隆单一未知基因,进行功能研究。2、表达谱分析法表达谱差异分析(differentialexpressionprofilin
g)主要包括基因表达谱(geneexpressionprofiling)和蛋白质表达谱(proteinexpression
profiling)[3,4,7]。大规模表达谱分析已经成为认识疾病分子机制的有利方法,在癌症研究等方面取得了一定的进
展[2～4]。成功的表达谱分析基于实验及其过程分析的有机结合。实验过程从关注的疾病开始,首先收集大量的疾病相关组织样本,样本数
量可从10多个到数百个,但必须足以对每一组织类型及个体差异进行比较分析,而且许多情况下不能仅简单地分为正常和疾病组织。例如,在对
糖尿病的研究中,所收集的样本来自健康人、胰岛素耐受和糖尿病病人的不同试验阶段,如胰岛素治疗前后。样品还应包括其他器官的取材,以便进
行基因表达的组织分布研究。为了便于对后来的实验数据进行分析管理,需采集并储存所有的组织样本和临床参数。接下来进行组织样本的处理,利
用生物芯片(寡核苷酸芯片、cDNA芯片或全基因组芯片)进行表达谱测定,并进行生物信息学分析。通常,表达谱的分析结果需进一步的实
验加以证实。定量RT2PCR?是最灵敏的确证方法,该方法还可以将确证实验的范围扩大到原测组织以外的更广泛的组织和组织类型,揭示基因
表达的组织分布情况。确证实验揭示了疾病相关基因。据此,可以进行进一步研究,探索这些基因的功能,开发新的治疗手段。例如,对于正常和疾
病组织中表达有显著性变化的基因,可以进行新治疗靶点的鉴定和确定研究,或利用实验和分析工具研究分析其功能;对于疾病组织中活性升高的酶
,可以当作前药活化酶进行鉴定研究。典型的表达谱能够显示疾病过程中有大量的已知基因表达的改变,而许多已知基因的代谢通路、表达产物酶学
分类和蛋白质功能业已发表,将两者对照分析,可以鉴定出酶活性,选择其中可能成为前药活化酶的部分进行进一步研究;对于疾病特异的蛋白质,
可以进行抗原表型分析,决定疫苗的开发策略[1]。寻找差异表达基因的方法除芯片技术外,一些新的检测方法如差异显示PCR(di
fferentialdisplayPCR,DD－PCR)、消减杂交(suppressionsubreactivehybridization,SSH)等也相继得到结合应用[8,9]。 |
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