 乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA形成机制的研究进展乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是我国慢性病毒性肝炎、肝硬化及相关肝癌的主要致病因素，我国77%的肝硬化和84%的肝细胞癌 (HCC)与之有关[1]。抗病毒治疗可明显减缓慢性乙型肝炎(CHB)的疾病进展，使我国近年来HBV相关肝硬化和肝纤维化的死亡率有所下降，但HBV相关肝癌的死亡率并未有明显改变[2]。已有足够的证据表明，慢性乙型肝炎的临床治愈可以进一步减少肝癌的发生。因此，慢性乙型肝炎患者的临床治愈已成为医生和患者的共同诉求。 一、共价闭合环状DNA(cccDNA)清除是乙型肝炎治愈的关键感染肝细胞核内以微小染色体的形式存在的cccDNA是HBV复制的模板，平均每个细胞内的cccDNA拷贝数在5～50[3]。其来源有从头感染(de novo infection)和内补充(intracellular recycling)两个途径。新感染的病毒颗粒核衣壳内部分双链松弛环状DNA(rcDNA)进入细胞核，经宿主DNA修复系统转换为cccDNA；而在已建立感染的肝细胞，cccDNA转录产生的前基因组RNA(pgRNA)在核衣壳内经逆转录合成出rcDNA，这些新合成的rcDNA除了能够以Dane颗粒的形式释放去感染新的肝细胞外，也可以返回核内补充cccDNA池[4]。由于以微小染色体形式存在的cccDNA缺乏着丝粒，在炎症或免疫调节治疗过程中，感染肝细胞的死亡和残存感染肝细胞的代偿性增殖均会导致cccDNA池因丢失而被稀释[5]。 现阶段的药物包括长效干扰素-α(IFN-α)和核苷(酸)类似物(NAs)两种，都不能直接靶向cccDNA。前者具有免疫调节作用，而NAs则通过与天然核苷酸dNTP竞争，掺入病毒DNA新链并不可逆地终止其延伸，使产生的缺陷型病毒颗粒失去感染性[6]。孙剑等[7]通过抗病毒治疗过程中血清HBV RNA耐药突变准种的动态变化，推测cccDNA的半衰期约6个月。这为我们通过影响从头感染和内补充两条途径以耗竭cccDNA提供了可能，但这往往需要长时间的抗病毒治疗。因此，了解HBV cccDNA的形成过程以及宿主细胞影响cccDNA合成的分子机制，对于研发新药、治愈乙型肝炎至关重要。 二、HBV通过从头感染使其基因组rcDNA入核转换为cccDNA在感染过程中，病毒包膜蛋白乙型肝炎表面抗原(HBsAg)与硫酸肝素乙酰蛋白多糖(HSPGs)以低亲和力结合于肝细胞膜上[8]，进而与肝细胞基底外侧膜上的钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)结合[9]，使病毒被内吞进入细胞并被包入内体。病毒包膜随即与内体膜融合释放出核衣壳。后者被运输至核孔复合体中并发生解体，其中的rcDNA与部分核心蛋白(core protein, HBc)进入胞核[10]。 进入细胞核内的rcDNA转化为cccDNA的过程主要包括正链5′末端RNA引物的去除、正链的补全、负链5′末端P蛋白(polymerase)和冗余片段“r序列”的去除。最终，正负链末端分别连接形成cccDNA，并随即发生染色质化成游离的微小染色体结构[11]。在这一过程中，正链5′末端加帽的18个核苷酸(nucleotide，nt)的RNA寡聚引物和负链5′末端约10 nt的冗余片段“r序列”所形成的襟翼结构主要由片段结构特异内切核酸酶1(FEN-1)等宿主因子移除[4]。而不完整的HBV DNA正链则可能被P蛋白和宿主细胞DNA聚合酶κ(POLK)、L(POLL)和H(POLH)延伸补齐[12]。 近期，魏磊等[13]利用酵母和人肝癌细胞提取物的生化合成体系，证明DNA滞后链(正链)合成和cccDNA形成的5种最基本蛋白质原件：增殖细胞核抗原(PCNA)、复制因子C(RFC)、DNA聚合酶δ(POL δ)、FEN-1和DNA连接酶1(LIG1)。但肝细胞内的cccDNA合成机制可能更为复杂，需要细胞DNA拓扑异构酶(TOP)[14]、DNA损伤反应系统ATR-CHK1途径[15]的参与等。 三、rcDNA的形成与cccDNA的内补充作为病毒RNA生成的模板，cccDNA可转录产生3.5、2.4、2.1和0.7 kb的HBV RNA。其中3.5 kb的前基因组RNA(pgRNA)既是翻译成核心蛋白和P蛋白的mRNA，其本身也是病毒逆转录复制合成rcDNA负链的模板[4]。以pgRNA为模板逆转录合成rcDNA的过程需要经过三次模板跳转。 起初，P蛋白识别pgRNA 5′末端附近的epsilon(ε)茎环，形成P-ε核糖核蛋白(RNP)复合物，被核心蛋白二聚体识别和包装，形成核心颗粒并在其中启动逆转录[16]。在伴侣蛋白的帮助下，P蛋白末端蛋白(TP)结构域中的酪氨酸从pgRNA近5′末端ε茎环的凸起区起始，以碱基配对的原则共价连接3～4 个核苷酸[(T)GAA]，并作为第一个模板引物从pgRNA 近5′末端ε茎环跳转至近3′末端的11 nt直接重复序列1(DR1)处[4]。接着，在P蛋白逆转录酶的作用下进行逆转录，将DNA负链延伸至pgRNA的5′末端，并使负链DNA 3′末端形成冗余片段。与此同时，P蛋白的RNase H结构域也同步介导了pgRNA的降解，而pgRNA 5′末端加帽且包含上游DR1的部分序列在DNA负链合成终止时得到保留[17]。这段未降解的序列从新合成DNA负链近3′末端的DR1跳转到负链近5′末端的DR2，作为第二个模板引物引导DNA正链合成[18]。在第二次跳转成功的基础上，DNA正链延伸至DNA负链的5′末端，新合成DNA正链的3′游离末端从负链的5′末端通过同源互补跳转至负链的3′末端，继续正链DNA的合成并形成rcDNA[19]。目前，我们实验室正在对这些精确跳转的分子机制进行探究。含有rcDNA的核衣壳(nucleocapsid)被病毒包膜糖蛋白包裹形成子代病毒，部分核衣壳也可穿梭回细胞核并继续转化为cccDNA，保持cccDNA池的相对稳定，此即为cccDNA的内补充机制。若第二次跳转失败，则在负链的3′端原位合成正链DNA，形成双链线性DNA(double-strand linear DNA, dslDNA)。dslDNA的发生频率约为rcDNA的5%～20%，主要整合到宿主基因组并能够转录表达HBsAg[4]。 四、cccDNA微小染色体与宿主的相互作用cccDNA形成后发生超螺旋，并被宿主蛋白(如组蛋白H3和H4)以及病毒蛋白(HBx和HBc)修饰，形成串珠样核小体结构，以游离的微小染色体形式存在。这一结构与宿主正常染色质存在着一定的相似性，具有逃避免疫系统攻击的潜力。但cccDNA微小染色体的核小体间隔(重复长度)为180 bp，与真核细胞染色体200 bp的核小体间隔不同[20]。此外，cccDNA无法进行半保留复制，因此在细胞周期过程中的表现与宿主DNA不同。 cccDNA微小染色体受到多种宿主转录调节因子、共刺激因子和病毒蛋白等单独或联合的调控，展现出与宿主相互作用的广阔图景。肝细胞核因子1/3/4(hepatocyte nuclear factors 1/3/4, HNF 1/3/4)、CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)等宿主因子可能促进cccDNA转录活性；染色体结构维持复合物5/6(SMC 5/6)、转化生长因子β(TGF-β)[21]等被发现可以抑制cccDNA活性。HBx蛋白可以调节多种限制性因子，减弱其抑制作用[22]。我们曾发现HBx可与阴阳1(YY1)蛋白协同介导cccDNA与宿主染色质19p13.11增强子的空间互作，激活HBV转录[23]。HBV包膜蛋白也被证明能够调节cccDNA的形成[24]。cccDNA微小染色体同样可以发生DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传修饰，以调节病毒基因表达和病毒复制[25]。cccDNA包含3个可能被甲基化的CpG岛，在慢性HBV感染患者体内存在不同程度的甲基化[26-27]。DNA甲基转移酶(DNMT)介导了病毒基因组的甲基化，可在体外抑制cccDNA转录及HBV复制[28]。此外，组蛋白甲基转移酶及去甲基化酶、组蛋白乙酰转移酶及去乙酰化酶均参与了对cccDNA微小染色体的组蛋白修饰[25]。黄爱龙等[29]研究表明，组蛋白去乙酰化酶SIRT3可结合至cccDNA微小染色体并协同组蛋白甲基转移酶抑制病毒复制。Yang等[30]对感染HBV的HepG2-NTCP细胞进行3C高通量全基因组易位测序(3C-HTGTS)，发现cccDNA更倾向存在于宿主基因组中富含H3K4me3、H3K9ac、H3K4me1和H3K27ac等组蛋白修饰的活跃增强子和启动子区域。 近年来，对cccDNA的研究日渐深入，但仍然存在许多未知。cccDNA微小染色体的形成过程与宿主细胞分子机制息息相关，体现出病毒感染的复杂性。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)等技术，可以对cccDNA结合蛋白进行精细的分析，为静默或清除cccDNA提供思路。CRISPR/Cas9等基因编辑工具已被证明可以靶向编辑和降解HBV cccDNA[31]。硫酸葡聚糖钠(dextran sodium sulfate, DSS)等小分子也或许可以阻止rcDNA转化为cccDNA[32]。随着有效治疗方法的介入，结合cccDNA较短的半衰期，有望在未来实现cccDNA的静默和清除，实现慢性乙型肝炎的临床治愈。 参 考 文 献 [1] 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南(2019年版). 肝脏，2019, 24:1335-1356. [2] Liu J, Liang W, Jing W, et al. Countdown to 2030: eliminating hepatitis?B disease, China. Bull World Health Organ, 2019, 97: 230-238. [3] Guo H, Xu C, Zhou T, et al. Characterization of the host factors required for hepadnavirus covalently closed circular (ccc) DNA formation. PLoS One, 2012, 7: e43270. [4] Wang J, Huang H, Liu Y, et al. HBV Genome and Life Cycle. Adv Exp Med Biol, 2020, 1179: 17-37. |
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