【原】CRISPR Cas9基因敲除技术原理图解

CRISPR Cas9简介及原理

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。细菌通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到 CRISPR 中，转录加工生成相应的crRNA（CRISPR-derived RNA），crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成的复合物能特异性识别外源DNA序列，引导Cas9核酸内切酶剪切外源DNA形成DNA双链断裂（double-strand breaks,DSBs），激起细胞以非同源末端连接或同源重组的方式进行修复。

一、

实验原理介绍

01 外源DNA俘获

CRISPR/Cas系统在这一步实现了一个识别功能。序CRISPR/Cas系统将识别出入侵者的“名字”（PAM）并找到它的原间隔序，然后把间隔序列记录到CRISPR序列中。

当噬菌体病毒首次入侵宿主细菌，病毒的双链DNA被注入细胞内部。CRISPR/Cas系统会从这段外源DNA中截取一段序列作为外源DNA的序列，然后将其作为新的间隔序列被整合到基因组的CRISPR序列之中。

因此，这段与间隔序列对应的“外源序列”被称为原间隔序列（protospacer）。然而，外源序列的选取并不是随机的。原间隔序列向两端延伸的几个碱基都十分保守，被称为原间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。

PAM通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基）。病毒入侵时，Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描这段外源DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原间隔序列。

随后，Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。然后，DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中

02 crRNA合成

CRISPR/Cas系统共有三种方式（Type Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。CRISPR/Cas9系统属于Type Ⅱ，是目前最成熟也是应用最广的类型。因此，本次分享将重点介绍CRISPR/Cas9的原理。

当外源DNA进入，CRISPR序列会在前导区的调控下转录出：pre-CRISPR-derived RNA (pre-crRNA)和trans-acting crRNA（tracrRNA）。其中，tracrRNA是由重复序列区转录而成的具有发卡结构的RNA，而pre-crRNA是由整个CRISPR序列转录而成的大型RNA分子。随后，pre-crRNA，tracrRNA以及Cas9编码的蛋白将会组装成一个小型“兵工厂”。

它将根据外源DNA的类型，选取对应间隔序列RNA，并在RNase Ⅲ的协助下对这段序列进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区）。

03 靶向干扰

Cas9/tracrRNA/crRNA这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。

crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。随后，Cas9蛋白发起猛烈攻势，其HNH酶活性将剪切crRNA互补的DNA链，而其RuvC活性位点将剪切非互补链。最终，Cas9使双链断裂（DSB）形成，最终使得外源DNA的表达被沉默

04 靶向机制

05 细节注意