中药蛋白质组学研究1994年澳大利亚Macquarie大学的Williams在《Electrophoresis》上首次提出了蛋白
质组(proteome)的概念[1]，指由一个基因组、细胞、组织或生物体所表?达的全部蛋白质，是通过生化方法对蛋白质进行大规模
研究的科学[2]。蛋白质组学（Proteomics）是以细胞或组织不同时间、不同环境下所有的蛋白质为研究对象，从整体上研究
蛋白质的种类、功能结构以及相互作用的一门科学，其强调蛋白质数量与类型在不同时间和条件下的动态本质，从而在细胞和生命有机体的整体
水平上阐明生命现象的本质和活动规律。其研究领域包括三个方面:①蛋白质大规模鉴定和转录后修饰的微特征研究；②差异显示蛋白质组学
,即对肿瘤等疾病有广泛应用前景的蛋白质表达水平的比较；③应用质谱技术和酵母双杂交体系对蛋白质间相互作用的研究。蛋白质组学是
专门研究细胞内全部蛋白的动态表?达，包括功能基因组学中所指的全部蛋白，而且还包含一部分非基因组编码的蛋白，如病毒中的蛋白（其不
是由基因组编码），所以通常也称之为功能基因组学(functionalgenomics)。Strohman等[3]的研究表明
,仅有2%的疾病与基因序列有关,而98%的疾病与蛋白质的表达有关。所以，基因组的研究必定要发展到蛋白质组研究，才能真正有助
于阐明生命活动的本质。随着科技的发展，蛋白质组学在中医药科学研究中的应用越来越多。本文通过对蛋白质组学在中药研究中的应用进行了
基础研究和总结，为今后中药蛋白质组学的研究者提供思路。1中药的蛋白质组学的研究对象中药的蛋白质组学研究的对象为中药及用中药（单体
化合物、中药组分或复方）处理后的生物体（细胞或组织）。2常用的蛋白质组学技术2.1蛋白质分离技术双向凝胶电泳(two-di
mensional-gel-ectrophoresis,2-DE)[4],?一种经典的蛋白质分离技术，由O’Farrell
等[5]于1975年首先创立，是蛋白质组学研究的核心技术。其基本原理:第一项基于蛋白质的等电点不同在pH梯度胶内进行等电聚
焦(Isoelectricfocusing)；第二项则根据分子量的大小不同进行SDS-PAGE分离，把复杂蛋白质混合物中
的蛋白质在二维平面上分开。但由于生物样品中如蛋白质大小的动态范围及表达量丰度的区别等蛋白质表达水平的差异，以及双向电泳技术对某
些蛋白质的“偏性”，极大的限制了其应用的范围[6-8]。因此，发展了更多的蛋白质分离技术，如色谱分离技术、毛细管电泳技术、毛
细管色谱技术、微流控芯片(Chip)?技术等。2.2质谱技术质谱(Massspectrometry，MS)?是测定
同位素峰的仪器，是质量筛选和分析器，通过检测无机或者有机化合物的质荷比(m/z)?对物质进行定性定量。质谱具有适用于多种化
合物、高选择性分析，重复性好，检测灵敏度在纳克以下，线性范围宽[9]等优势，是目前最常用的，也是最主要的蛋白质鉴定技术。2.3
蛋白质相互作用技术在体内，蛋白质几乎不单独执行它们的独立功能，已经证明80%的蛋白没有单独执行功能，而是形成蛋白复合物发挥作用
[10]。蛋白质互作(PPI)及其构建的作用网络在生命活动中发挥着极其重要的作用[11]，如细胞信号的转导和调控、代谢途径和
大分子结构的形成等[12]。包括酵母双杂交技术、串联亲和化技术、免疫共沉淀技术、GSTPull-down技术、荧光共振能量转
移和表面等离子共振分析技术等。2.4蛋白质芯片蛋白质芯片技术是基因芯片技术发展的产物[13]，指将微量蛋白质固定于固相载体，
通过高灵敏度读取系统对样品溶液进行分析的技术[14]，它能够同时检测实验中微量样品大量不同的参数，具有高通量性、敏感性、可重复性
、稳定性和自动化的特点，可用于蛋白质表达谱分析、研究蛋白质间的相互作用、描述抗体特性、监测自身免疫性疾病的特异抗原、进行药物筛
选等[15]。3蛋白质组学在中药研究中的应用以疾病为基础，经过中药体系的治疗，再通过蛋白质组学技术研究中药作用机制的研究思路是
蛋白质组学在中药研究中的通用思路。以往的研究表明，蛋白质组学在中药研究中的应用主要有5个方面：①通过比较中药不同产地，野生与
栽培，不同组分等蛋白质组表达谱的差异，研究中药药用功能的机制；②通过比较正常状态、病理状态以及通过单味药和复方药提取物治疗后蛋
白质组表达谱的差异，寻找可能的相关靶点蛋白；③通过生物信息学方法预测中药单体化合物与特异性靶点的相互作用，再利用BIAco
re生物大分子相互作用仪对中药单体化合物进行体外相互作用的筛选及验证；④通过比较蛋白质组学的结果，结合在蛋白质相互作用数据
库中与中药相互作用的蛋白信息，利用生物信息学技术绘制出与中药作用相关的蛋白质相互作用网络，并对特异性靶点运用生物学的实验手段(
?如酵母双杂交，免疫共沉淀，基因过表达及基因敲除技术)?对蛋白质相互作用信号网络进行验证；⑤比较中药体系对疾病治疗后的蛋白
修饰谱，如组蛋白乙酰化修饰谱，泛素化修饰谱等，研究中药体系对于靶点蛋白的修饰作用。3.1基于蛋白质组学的中药鉴定研究中药蛋白质
组学指纹图谱能提供量效相关信息，起到鉴定和研发的双重作用，比较不同蛋白质指纹图谱体现的不同药效结果，就可确定该制剂的最佳成分配伍
，这对于中成药的二次开发和中药新药的研制有显著的意义。Lum?等[17]利用2-DE研究了西洋参主根、人参不同取材部位（主根
、侧根、芦头、表皮）以及组织培养野生人参细胞的蛋白质表达谱，结果显示不同参样本的2-DE?图谱（指纹谱）显著不同，能够
轻易地分辨开来，而传统的基于色谱和分析鉴定技术却达不到这一效果。李春梅等[18-19]应用激光解析/离子化-飞行时间质谱技术(S
ELDI-TOFMS)对传统中药龟甲胶、阿胶蛋白/肽成分进行蛋白质组初步分析，分别获得的有意义蛋白/肽共计6.9?个
。通过分析建立龟甲胶、阿胶蛋白质/肽成分质量指纹图，可作为龟甲胶、阿胶数字化质控标准；并为进一步分离、纯化及验证龟甲胶、阿
胶功能相关活性蛋白质/肽成分提供可靠信息。3.2基于蛋白质组学的中药质量评价研究蛋白质组学技术的应用，使我们能通过对用药前后组织
或细胞的差异蛋白质组展示来评价中药的药效，而且可以针对其中特异表达或差异表达显著的蛋白点进行更深一步的后续质谱鉴定研究，确定药
物作用的靶蛋白，这种全景式分析研究方法必将大大加速中药活性筛选过程。张萃等[20]通过内毒素诱导的炎症细胞模型，从丹参酮Ⅰ、
丹参酮ⅡA、盐酸川芎嗪、阿魏酸、姜黄素、莪术油中筛选抗炎活血化瘀中药单体，发现丹参酮ⅡA对内毒素诱导的炎症细胞模型有明显抑
制作用，双向电泳图象分析筛选出差异性明显的蛋白质点26个。模型组有16个蛋白点增高，丹参酮ⅡA能使其中的13个蛋
白点下调（占50%），3个进一步上调（占11.5%）；而对模型组表达下调的10个蛋白点，丹参酮ⅡA对其均有不同程
度上调趋势。故内毒素感染的细胞模型适合实验室小剂量中药单体的筛选，丹参酮ⅡA的抗炎作用与这些差异表达蛋白质有关，能够调节一些
蛋白质的表达。3.3基于蛋白质组学的中药药理研究王勇等[21]采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱(MAL
DI-TOF)?初步发现中华小型猪心肌缺血血瘀证模型存在的差异蛋白主要是氧化应激蛋白及相关的心肌结构蛋白，包括热休克蛋白27
(HSP27)?、过氧化物酶(peroxiredoxin3isoform?1)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、
肌球蛋白(myosinlightpolypeptide)，为临床冠心病心肌缺血血瘀证药物治疗提供可能的靶标。战丽彬等[2
2]通过双向凝胶电泳分离脾阴虚证大鼠海马蛋白质组初步筛选出脾阴虚大鼠海马蛋白质组的差异表达，发现脾阴虚组海马蛋白质组中有6个
明显的差异蛋白点，其中5个蛋白点表达明显下调，1个表达显著上调，并推测这些差异表达与学习记忆相关。3.4蛋白组学在中药
代谢调控中的应用植物各组织（器官）和细胞器中的许多蛋白在植物生长发育过程中发生变化。大部分中药材中含有与光合作用、代谢、细胞分裂
、成熟相关的蛋白质。通过对这些蛋白质的比较研究，可掌握药用资源生物生长成熟过程中与可利用物质相关的蛋白质的变化规律，可为从分子
水平对药用资源生物可利用物质生物合成进行定向调控提供依据。Dong等[24]发现，在成熟过程中蛋白质组学多态性在毛毛虫体内和冬
虫夏草基质中呈动态变化。毛孢(HS)和蝙蝠蛾拟青霉(PH)蛋白质组学多态性与冬虫夏草不同，这表明，在成熟过程中与冬虫夏草相关的
真菌和多种冬虫夏草基因型存在差异蛋白表达。章燕珍[25]应用紫外线B波(UV-B)诱导技术对活体阔叶十大功劳叶进行紫外诱导及
相关蛋白质组学分析。通过对6hUV-B照射、不同时间培养后的指纹图谱进行分析，发现阔叶十大功劳中次生代谢产物有显著的变化。
与对照组相比，药根碱、非洲防己碱、巴马汀和小檗碱分别增加了919.6%、391.4%、192.4%和33.1%。通过基质辅助
激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)鉴定，普通双向电泳得到了13个差异点，利用组合肽配体库技术后，检测到
了91个新蛋白点，同时异喹啉生物碱合成的6个关键酶基因经诱导后也显著提高。3.5利用蛋白质组学寻找中药作用相关靶点蛋白
3.5.1中药单体化合物作用相关靶点蛋白的寻找2003年，MacKeigan等[26]通过蛋白质组学研究发现MEK抑制剂
和紫杉醇(paclitaxel/taxol)合用时改变了RhoGDIα(RhoGDP-dissociation
inhibitorα)和RS/DJ-1(RNA-bindingregulatorysubunit/DJ-1PAR
K7)蛋白的表达；2005年，Lee?等[27]利用蛋白质组学的方法研究了紫杉醇作用于人宫颈癌HeLa细胞可能的靶点蛋白
；2010年，Cui等[28]运用蛋白质组学技术研究了中药灵芝单体化合物9,11-dehydroergosterol
peroxide对于人宫颈癌HeLa细胞毒性的作用机制。3.5.2中药复方提取物作用相关靶点蛋白的寻找2006年，Liu
?等[29]研究了由熟地黄、当归、白芍和川芎4味中药组成的四物汤对于由环磷酰胺导致的血虚证小鼠骨髓蛋白质组的影响，结果发现
四物汤可能通过影响与细胞凋亡和造血祖细胞增殖分化相关的蛋白，进而促进骨髓造血；2009年，Lee等[30]考察了由茵陈蒿、
大黄和栀子等中药组成的复方茵陈蒿汤(Yin-Chen-Hao-Tang)作用于由胆管结扎造成的肝纤维化模型大鼠27d后肝脏蛋
白质组的表达变化，结果发现茵陈蒿汤治疗大鼠肝纤维化的作用机制可能与调控脂类物质的生物合成抑制以及正常肝细胞的凋亡有关。2012
年，Yue等[31]通过蛋白质组学技术考察了丹参多酚酸和三七总皂苷联合应用对于心肌缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用。3.6
中药直接结合靶点蛋白的预测和验证利用分子对接技术高通量筛选中药单体化合物，再通过体内外实验验证中药单体的药效是目前寻找中药有效
成分的较好的一种高通量药物筛选方式。这种药物筛选方式依靠日益完善的蛋白质空间结构数据库，常用的蛋白质空间结构数据库有PDB、MM
DB、ISSD、CATH、SCOP?等；其中，PDB(proteindatabank)数据库是目前收录最为详尽的蛋白质
结构数据库，该数据库包含了通过X?射线晶体衍射和磁共振获得的蛋白质三维结构数据。PDB?数据库由美国Brookhaven
实验室于1971年建立[32]，收录了通过X射线晶体衍射、核磁共振和电子显微镜方法测定的生物大分子的三维结构。分子
对接技术包括正向对接及反向对接，正向对接是指通过蛋白质的空间结构搜索与其特异性结合的小分子，而反向对接则是根据其提供的蛋白质空
间结构采用小分子配体搜索潜在结合蛋白的方法，2种技术都可以预测中药单体化合物与靶点蛋白的相互作用。目前用于分子对接的软件有
DiscoveryStudio，AutoDock，Surflex，FlexX，MVD，INVDOCK等。Yue?
等采用反向对接软件(INVDOCK)寻找能够分别与灵芝酸D和丹酚酸B直接结合的靶点蛋白，结果表明，14-3-3蛋白可能
是灵芝酸D直接结合的靶点蛋白[33]，而EGFR蛋白可能是丹酚酸B直接结合的靶点蛋白[34]。然而分子对接的实验
结果必须利用实验技术来验证，常用的实验验证手段包括体外细胞实验，Elisa试剂盒验证以及采用BIAcore生物大分子相互
作用仪通过体外表面等离子体共振技术对中药单体化合物与靶点蛋白的结合活性进行验证[35]。3.7中药相关靶点蛋白相互作用信号网络
的绘制和验证随着蛋白质相互作用研究技术的发展，目前已经获得了大量的蛋白质相互作用数据，如BIND数据库(http://bin
d.ca/)、DIP数据库(http://dip.doe-mbi.Ucla.edu/)和STRING数据库(http://
string.emb1.de/)。例如，2011年Feng[36]和Ma?等[37]分别采用该方法绘制了丹酚酸B?的靶
点蛋白相互作用网络结构。而对于网络结构中的一些关键蛋白，可以采用基因敲除或过表达的方式来验证其相互作用。对于网络中一些预测的中
间蛋白，可以采用生物学实验，如RNA干扰、基因过表达等，进行深入研究。绘制靶点作用网络的方法特别适合中药的研究；最新的研
究理念认为不需要过度抑制或者激活某一条信号通路或者生物网络，多种靶点蛋白低亲和力的相互作用可能更有效和更全地稳定整个网络[38
]，而中药单体化合物、有效部位和复方均具有多靶点和低亲和力调控生物信号网络的特性[39]。4小结中药是我国传统文化的重要财富，
也是现代医药可持续发展的宝贵资源。历经千年的传承，中药的科学性、有效性和实用性已得到诸多的验证。2015年屠呦呦凭借青蒿素获得
诺贝尔生理学或医学奖，是中药应用于世界医学研究中的一次伟大胜利，赢得了世界对中药单体研究的认可，为中药的现代化发展作出了巨大贡献。中药复杂体系的研究需要以中医药传统的论体系为指导，借助现代生物医学的研究方法，需要多种技术的辅助、多学科的渗透交叉才能够系统、全面、正确地阐明中药尤其是复方的作用靶点、作用环节和作用过程。在大数据时代，基于基因组学、蛋白质组学转录组学、代谢组学等多种组学技术平台的系统生物学是中药现代化研究的所必备的。同时，蛋白质组学在中药复杂体系中的应用为中药的现代化发展带来巨大的机遇。但是蛋白质组学技术来中药作用机制的研究中仍然处于初级阶段，往往流于蛋白质表达谱的变化，却没有更深入的对机制的探索。在今后的发展中，应该集中蛋白质及基因、细胞等方面的优势力量，充分利用各种已有的研究基础与成果，开展蛋白质组学与中药现代化的研究，尝试建立中药与蛋白质组学相关联的转换模式概念，从而更深层次地揭示中药治疗的现代科学理论基础。总之，在与蛋白质组学相结合的中药研究将会有更广阔的发展前景。 |
|
