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第一作者：WuTao 通讯作者：ZhangXueli 通讯地址：中国科学院天津工业生物技术研究所，天津300308 论文DOI：10.1016/j.ymben.2017.07.001 类胡萝卜素是一类具有商业价值的萜烯，具有重要的生物学功能。尽管已经应用了各种策略来设计微生物细胞工厂中β-胡萝卜素的生产，但是还没有研究和改进疏水性萜烯产物在异源宿主细胞中的储存。尽管膜被认为是积累疏水性萜类如β胡萝卜素的细胞隔室，但仍缺乏直接证据。在这项工作中，我们从形态和生物合成两个方面对大肠杆菌的膜进行了工程改造，以研究和提高其对β-胡萝卜素的储存能力。通过过度表达膜弯曲蛋白工程化膜形态使得β-胡萝卜素特异生产值增加28%，而工程化膜合成途径导致43%的增加。此外，这两种策略的结合具有协同效应，导致β-胡萝卜素比生产值增加了2.9倍(从6.7毫克/克DCW增加到19.6毫克/克)。 在工程大肠杆菌细胞的电子显微镜图像中观察到向内的膜堆叠，这表明形态变化与β-胡萝卜素储存能力的增加相关。最后，膜分离和分析证实增加的β-胡萝卜素主要在细胞膜内积累。这种膜工程策略也应用于β-胡萝卜素高产菌株CAR025，导致已经很高的β-胡萝卜素比生产值增加了39%(在摇瓶中从31.8到44.2毫克/克DCW)，使其成为在可比较的培养条件下报告的最高生产值之一。本研究开发的膜工程策略为工程化和改良微生物萜烯生产菌开辟了新的方向。很有可能使用这种新的工程策略可以进一步改进用于生产疏水化合物的各种菌株。 本文中，我们提出了一种新颖的方法来提高微生物对β-胡萝卜素的储存能力。在全球代谢网络的规模上，系统和组合方法被用来鉴定基因敲除或基因过表达的目标，以提高β-胡萝卜素的产量；此外，还设计了中央代谢模块来增加ATP和NADPH的供应。在本项工作中，通过构建质粒pM1-37Almgs、pM1-46Almgs和pM1-93Almgs，分别在M1-37、M1-46和M1-93启动子的控制下将Almgs整合到大肠杆菌染色体中。 将质粒pCas9与每个质粒共电穿孔到β-胡萝卜素生产菌株CAR015中，并使用前述Cas9基因组编辑方案处理所得菌株，产生Almgs整合菌株。本研究中使用的膜弯曲蛋白包括甘露醇渗透酶MtlA和趋化受体Tsr，以及Almgs和其两个功能缺陷突变体E300A和E308A，旨在通过引入膜弯曲蛋白和增强膜合成途径来改造大肠杆菌的细胞膜，并借以提高β-胡萝卜素的产生和积累。 类胡萝卜素是一类具有商业价值的萜烯，具有重要的生物学功能。除了刺激人体免疫系统外，β-胡萝卜素还具有抗氧化剂的功能，并对癌症有保护作用。它也是维生素A的前体，在药物、营养制品、化妆品和食品中有许多应用。虽然已经进行了广泛的研究来开发大肠杆菌的β-胡萝卜素生产菌株，但据知，还没有进行任何工程工作来改善疏水性萜烯产物在异源微生物宿主中的储存。 与积累在细胞质中的脂肪酸、聚羟基丁酸酯或脂质不同，疏水性萜烯产物被认为积累在大肠杆菌的膜室中，因此，扩大膜表面积和增加膜结构的数量可能是增加β-胡萝卜素在大肠杆菌细胞中积累的可行策略。据报道，大量内源性整合膜蛋白，即富马酸还原酶、ATP合酶、ATP合酶b亚单位、甘露醇通透酶MtlA和趋化受体Tsr的过表达诱导细胞质中膜堆或小管的形成，这些膜堆或小管靠近细胞质并与其连续。 负责合成非双层糖脂-葡萄糖基-二酰甘油(GlcDAG)的糖基转移酶单葡萄糖基二酰甘油合酶(Almgs)在大肠杆菌中过表达，并诱导细胞内膜泡的广泛形成，从代谢工程的角度来看，这些蛋白质可能被用作修饰细胞膜的新工具。另一方面，膜合成是另一个可以调节和改进的方面。甘油磷脂和磷酸甘油酯是甘油基磷脂，是生物膜的结构成分。因此，调节二酰基甘油-3-磷酸合成途径以增加膜构件的量可能是增加总膜含量并因此增加疏水性萜烯产物积累的有效策略。 图1为表达多种膜弯曲蛋白的菌株CAR015的β-胡萝卜素效价和比生产值。在Ptrc启动子的控制下，用中拷贝质粒pACYC184-M表达这些基因。所有的膜弯曲蛋白都在不同程度上提高了β-胡萝卜素的特异生产值，其中Almgs的效果最为显著。菌株CAR015(pAlmgs)生长48 h后产生27.4mg/L β-胡萝卜素，比生产值为8.6 mg/g DCW，分别比亲本菌株高37.5%和28.3%。 由此发现，表达具有膜终止功能的蛋白质实际上提高了大肠杆菌中β-胡萝卜素的产量，这表明膜工程是增加疏水性萜烯甚至具有类似储存机制的其他产品产量的新方向。结果也间接表明β胡萝卜素在膜室中积累，因此，增加的膜内表面积很可能容纳更多的β-胡萝卜素分子，并有利于其生产。 图2显示了通过将almgs整合到菌株CAR015的染色体中，然后进行基因表达调节，获得工程大肠杆菌菌株的β-胡萝卜素效价和比生产值。 与亲本菌株CAR015相比，所有三个工程菌株都具有显著更高的β胡萝卜素比生产值(p < 0.001)，其中在M1-37控制下的almgs表达给出了最高的比生产值和滴度(分别为11.5 mg/ g DCW和36.9 mg/L)。 图3为过量表达膜合成基因获得的CAR015菌株的β-胡萝卜素效价和比生产值。通过单独过表达plsb，用plsc过表达plsb，用plsc和dgka过表达或 plsb来设计膜合成，来增强β-胡萝卜素的积累。结果显示β-胡萝卜素的比生产值和效价确实比亲本菌株有所提高，CAR015(pPlsb-plsc)表现最高，分别为9.7 mg/g DCW和31.3 mg/L。 该结果在统计学上显著高于亲本菌株CAR015(pACYC184-M)的测量值(p < 0.001)。plsb和plsc的同时过表达可能增加了甘油三酯-磷酸合成的途径流量，进而增加了膜结构的数量，并提供了更多的空间来储存β-胡萝卜素。 图4显示了过表达plsb+plsc或plsb+plsc+dgka的菌株CAR 015-37 Almgs的β-胡萝卜素效价和比生产值。虽然两个菌株的表现都有所改善，但菌株CAR015-37Almgs(pPlsbplsc)的β-胡萝卜素产量增加更明显。该菌株产生103.5毫克/升β-胡萝卜素，具体产生值为19.6毫克/克DCW，分别比亲本菌株CAR015-37Almgs(pACYC184-M)高146%和51.9%。 与亲本菌株CAR015(pACYC184-M)相比，β-胡萝卜素效价和比生产值分别提高了5.2倍和2.9倍。菌株car 015-37almsg(pPlsb-plsc)中β-胡萝卜素产量的显著提高(P < 0.001)表明膜合成和膜形态工程的巨大协同效应。在膜形态工程水平上，Almgs诱导了膜堆或小管的形成并增加了膜表面积，这必然也增加了对膜构件的需求，这是实现如此形态变化所需要的。因此，plsb和plsc的过表达增强了膜的合成，适应了对膜构件的需求，并实现了对β-胡萝卜素生产的协同作用。 如图5所示，亲本菌株CAR015(pACYC184-M)的细胞具有正常的杆状，并且它们的细胞膜完整且光滑。该结果表明原始β-胡萝卜素生产者具有正常的膜形态，证明β-胡萝卜素生产本身不影响细胞形状。相比之下，菌株CAR015(pAlmgs)在观察到的群体中显示出细胞形状的差异，具有细长的细胞和带有细胞内叠层的粗糙膜，类似于先前报道的膜工程野生型大肠杆菌的观察。 深色细胞质周围的灰色膜区域似乎扩大了，这可能是由于积累的β-胡萝卜素与膜结合。最高产菌株CAR015-37Almgs(pPlsb-plsc)也观察到相同的细胞形态。在一些细胞中观察到非常清晰的膜泡和叠层，而在亲代菌株的任何细胞中都没有观察到。因此，形态学证据表明，膜工程策略实际上改变了膜的形状，增加了膜结构的细胞数量，这反过来可能增加了异源产生的β-胡萝卜素的积累。 图6所示为菌株CAR025(pACYC184-M)和car025-37almgs(ppls B- plsc)β-胡萝卜素比生产值的比较。为了进一步证明这种膜工程策略的能力，对新获得的β-胡萝卜素高产菌株(CAR025)进行了膜修饰，以提高其β-胡萝卜素的积累和产量。该菌株在摇瓶发酵中产生196.3毫克/升的β-胡萝卜素，比生产值为31.8毫克/克DCW。 将M1-37控制的almgs整合到染色体中，用质粒pPlsb-plsc转化后，在相同条件下，菌株CAR025-37Almgs(pPlsb-plsc)产生268.1mg/Lβ胡萝卜素，比生产值为44.2 mg/g DCW，分别比亲本菌株CAR025(pACYC184-M)高37%和39%，虽然比生产值提高显著(P < 0.01)，但低于相对较弱的β-胡萝卜素生产者CAR015。然而，这是合理的，因为其他因素，如前体的供应、能量和还原当量，可能已经成为过度繁殖菌株的限制因素。然而，在相似的培养条件下，菌株CAR025-37Almgs(pPlsb-plsc)的β-胡萝卜素比生产值是报道的最高比生产值之一。 本工作从形态和生物合成两个方面对大肠杆菌细胞膜进行了改造，提高了其对β-胡萝卜素的储存能力。通过膜工程，获得了优良的β-胡萝卜素生产菌株，其比生产值比亲本菌株CAR015增加了2.9倍。当这种膜工程策略应用于β-胡萝卜素高产菌株CAR025时，获得了44.2 mg/g DCW的非常高的比生产值，比亲本菌株高39%。因此，膜工程代表了一种提高β-胡萝卜素以及其他疏水产品产量的新策略。使用这种新的工程策略，很有可能进一步改进用于各种疏水产品的微生物细胞工厂。 文献链接： https:///10.1016/j.ymben.2017.07.001 |
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